本文關(guān)鍵詞：人淚腺腺樣囊性癌細(xì)胞系異種種植研究及其腫瘤干細(xì)胞的分離培養(yǎng)和鑒定

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【摘要】：目的 1.探討人淚腺腺樣囊性癌細(xì)胞系的生物學(xué)特性。 2.建立人淚腺腺樣囊性癌的動物模型,為研究淚腺腺樣囊性癌的發(fā)生發(fā)展以及治療提供實驗依據(jù)和條件。 3.從人淚腺腺樣囊性癌細(xì)胞系LACC中分離培養(yǎng)淚腺腺樣囊性癌腫瘤干細(xì)胞,并對其特性進(jìn)行鑒定。 方法 1.實驗第一部分：將人淚腺腺樣囊性癌(lacrimal adenoid cystic carcinoma,LACC)細(xì)胞系接種于10只裸鼠腋下的皮下,注射細(xì)胞懸液后每天觀察裸鼠并測量裸鼠荷瘤的最長徑L和最短徑W,并用公式V(荷瘤體積)=(L×W2)/2計算出荷瘤的體積。分別于注射細(xì)胞懸液后14天、28天、35天、42天、49天隨機取2只裸鼠的荷瘤以及裸鼠的肝臟、肺和腋下淋巴結(jié)。對注射細(xì)胞后14天的荷瘤行透射電鏡觀察,對注射細(xì)胞后14天、28天、35天、42天、49天的荷瘤行HE染色、免疫組織化學(xué)染色檢測Keratin、Vimentin、α-SMA、S-100、Desmin的表達(dá)以及提取其總RNA,用RT-PCR檢測該荷瘤的人類β-actin的表達(dá)情況。對所取的裸鼠肝臟、肺和腋下淋巴結(jié)組織切片,行HE染色,觀察有無腫瘤轉(zhuǎn)移。 2.實驗第二部分：將LACC細(xì)胞消化、離心制成單細(xì)胞懸液,懸浮于無血清培養(yǎng)基(serum free medium,SFM)中獲得腫瘤細(xì)胞微球體；應(yīng)用有限稀釋和單克隆形成實驗確定該細(xì)胞系中腫瘤干細(xì)胞的比例；MTT檢測腫瘤微球體的增殖能力以及其耐藥性；流式細(xì)胞儀檢測細(xì)胞表面分子標(biāo)志CD44+/CD24-在兩種細(xì)胞中的表達(dá)情況；向SFM中滴加含有血清培養(yǎng)基(serum supplied medium,SSM)誘導(dǎo)LACC腫瘤微球體分化,并觀察其形態(tài)學(xué)變化。 結(jié)果 1.接種細(xì)胞系后7天10只裸鼠腋下皮下全部長出荷瘤,成瘤率為100%。注射細(xì)胞懸液后14天取出的荷瘤呈圓形或橢圓形,表面可見包膜；不與周圍組織粘連；荷瘤質(zhì)地中等,剖面呈蒼白色。注射細(xì)胞懸液后49天的荷瘤表面仍可見包膜,荷瘤侵入裸鼠胸壁,甚至侵入胸腔生長,但不與胸腔臟器粘連。 2.荷瘤的組織形態(tài)學(xué)及生物學(xué)行為觀察：1)HE染色觀察見荷瘤具有典型的上皮性腫瘤組織結(jié)構(gòu)。荷瘤以實體形為主,局部見粘液變、篩網(wǎng)樣結(jié)構(gòu)；細(xì)胞為圓形或橢圓形,細(xì)胞邊界不太清楚,有豐富的粉染的胞漿,細(xì)胞核深染、大小差異明顯,可見瘤巨細(xì)胞,病理性核分裂常見。2)透射電子顯微鏡下觀察示荷瘤瘤細(xì)胞大小不等。相鄰細(xì)胞間以縫隙連接為主,偶見發(fā)育不良的橋粒,細(xì)胞表面有微絨毛,未見明確腺管形成。胞漿內(nèi)粗面內(nèi)質(zhì)網(wǎng)輕度擴張,散在線粒體,可見多聚核糖核蛋白體。有些腫瘤細(xì)胞胞漿中可見束狀微絲。核漿比例倒置,核形態(tài)不規(guī)則,核膜凹陷,可見多核仁,核周間隙擴大。未見到典型核分裂相。 3)免疫組織化學(xué)染色示荷瘤對Keratin、Vimentin、α-SMA、S-100陽性表達(dá),Desmin陰性表達(dá)。4)RT-PCR檢測荷瘤表達(dá)人類β-actin基因。5)光鏡下觀察,未發(fā)現(xiàn)腫瘤轉(zhuǎn)移至裸鼠肝臟、肺和腋下淋巴結(jié)。 3. LACC細(xì)胞系中有(0.92±0.015)%的腫瘤細(xì)胞在無血清培養(yǎng)基中能夠存活增殖形成自由漂浮的細(xì)胞微球體；微球體形狀規(guī)則,立體感強,球體內(nèi)細(xì)胞排列緊密,富有折光性,并可穩(wěn)定傳代。與貼壁細(xì)胞相比,LACC腫瘤微球體具有更強的體外增殖能力、對順鉑具有更強的耐藥性。流式細(xì)胞儀表面標(biāo)志檢測,LACC細(xì)胞CD44+/CD24比率為23.77%,而LACC腫瘤微球體CD44+/CD24比率為84.25%。在含血清環(huán)境下LACC腫瘤細(xì)胞微球體可分化為貼壁生長的單層細(xì)胞,與SSM中培養(yǎng)的LACC細(xì)胞無明顯差異。 結(jié)論1.人淚腺腺樣囊性癌細(xì)胞系(LACC)具有一般惡性腫瘤的特點,同時也具有腺樣囊性癌細(xì)胞的特點。荷瘤具有與原瘤一致的組織學(xué)特性,該動物模型易復(fù)制,時間短,成功率高,是研究淚腺腺樣囊性癌的良好模型,為研究該腫瘤的發(fā)生發(fā)展以及治療途徑提供了一個極為有用的工具。 2.用含有生長因子的SFM懸浮人淚腺腺樣囊性癌細(xì)胞系LACC可獲得淚腺腺樣囊性癌腫瘤細(xì)胞微球體,此腫瘤微球體中富集有腫瘤干細(xì)胞,這為人淚腺腺樣囊性癌腫瘤干細(xì)胞的研究提供了一個理想的模型系統(tǒng)。
【關(guān)鍵詞】：淚腺腺樣囊性癌 腫瘤細(xì)胞系 裸鼠 動物模型 腫瘤干細(xì)胞 無血清培養(yǎng)基
【學(xué)位授予單位】：天津醫(yī)科大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2014
【分類號】：R739.7
【目錄】：

• 中文摘要4-6
• Abstract6-8
• 目錄8-11
• 縮略語/符號說明11-12
• 前言12-16
• 研究現(xiàn)狀、成果12-14
• 研究目的、方法14-16
• 一、人淚腺腺樣囊性癌細(xì)胞系異種種植研究16-35
• 1.1 對象和方法16-26
• 1.1.1 實驗動物16
• 1.1.2 細(xì)胞系16
• 1.1.3 主要儀器16-17
• 1.1.4 主要試劑、耗材17-19
• 1.1.5 細(xì)胞培養(yǎng)19-20
• 1.1.6 制備一定密度的細(xì)胞懸液20-21
• 1.1.7 異種種植實驗21
• 1.1.8 HE染色21
• 1.1.9 透射電鏡觀察荷瘤21
• 1.1.10 免疫化學(xué)染色21-23
• 1.1.11 LACC荷瘤、細(xì)胞系以及裸鼠肝臟中人類β-actin和小鼠β-actin基因表達(dá)檢測23-26
• 1.2 結(jié)果26-32
• 1.2.1 皮下荷瘤生長情況26-28
• 1.2.2 荷瘤的組織學(xué)觀察28
• 1.2.3 腫瘤轉(zhuǎn)移情況28
• 1.2.4 透射電鏡觀察荷瘤28-30
• 1.2.5 免疫化學(xué)染色觀察30-31
• 1.2.6 人類β-actin和小鼠β-actin基因表達(dá)31-32
• 1.3 討論32-34
• 1.3.1 LACC細(xì)胞系裸鼠異種種植33-34
• 1.3.2 LACC荷瘤的組織生物學(xué)特性34
• 1.4 小結(jié)34-35
• 二、人淚腺腺樣囊性癌細(xì)胞系腫瘤干細(xì)胞分離培養(yǎng)和鑒定35-49
• 2.1 對象和方法35-40
• 2.1.1 細(xì)胞系35
• 2.1.2 主要儀器35
• 2.1.3 主要試劑、耗材35-37
• 2.1.4 LACC中腫瘤微球體的分離培養(yǎng)和傳代37-38
• 2.1.5 有限稀釋、單克隆形成實驗38
• 2.1.6 MTT法檢測LACC腫瘤微球體體外增殖能力38-39
• 2.1.7 藥物敏感實驗39
• 2.1.8 流式細(xì)胞儀檢測CD44~+/CD24~-的表達(dá)39-40
• 2.1.9 LACC腫瘤微球體分化能力40
• 2.1.10 統(tǒng)計學(xué)方法40
• 2.2 結(jié)果40-46
• 2.2.1 顯微鏡下觀察LACC腫瘤微球體的形成40-42
• 2.2.2 有限稀釋、單克隆形成實驗42-43
• 2.2.3 細(xì)胞增殖實驗43-44
• 2.2.4 兩種細(xì)胞對順鉑的敏感性44
• 2.2.5 CD44~+/CD24~-在兩種細(xì)胞中的表達(dá)44-46
• 2.2.6 LACC腫瘤微球體分化能力46
• 2.3 討論46-48
• 2.3.1 LACC腫瘤干細(xì)胞分離培養(yǎng)46-47
• 2.3.2 LACC腫瘤干細(xì)胞的鑒定47-48
• 2.4 小結(jié)48-49
• 結(jié)論49-50
• 參考文獻(xiàn)50-54
• 發(fā)表論文和參加科研情況說明54-55
• 綜述 腺樣囊性癌腫瘤干細(xì)胞標(biāo)志物的研究進(jìn)展55-64
• 綜述參考文獻(xiàn)61-64
• 致謝64

【參考文獻(xiàn)】

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本文編號：1086653