本文關(guān)鍵詞：DNA甲基化介導(dǎo)的氧化應(yīng)激相關(guān)基因CRYAA及GJA3在年齡相關(guān)性核性白內(nèi)障中的篩選及作用機(jī)制研究

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【摘要】：第一部分DNA甲基化介導(dǎo)的氧化應(yīng)激相關(guān)基因在年齡相關(guān) 目的年齡相關(guān)性白內(nèi)障(ARC)是全球首位致盲性眼病,氧化應(yīng)激在ARC的發(fā)病中起到重要作用。本研究旨在通過(guò)全基因組啟動(dòng)子區(qū)DNA甲基化芯片對(duì)年齡相關(guān)性核性白內(nèi)障患者的晶狀體上皮囊膜和眼庫(kù)中年齡匹配的無(wú)明顯白內(nèi)障的眼球的晶狀體上皮囊膜進(jìn)行檢測(cè)分析,篩選出由DNA甲基化調(diào)控的與氧化應(yīng)激相關(guān)的基因,并進(jìn)行驗(yàn)證。 材料與方法收集白內(nèi)障手術(shù)中撕下的晶狀體前囊膜30例作為ARC組,入選標(biāo)準(zhǔn)為60歲以上核性ARC患者,LOCS III分級(jí)為NC≥4級(jí)；對(duì)照組選取我院眼庫(kù)來(lái)源的無(wú)明顯白內(nèi)障的眼球晶狀體前囊膜30例,兩組囊膜提取基因組DNA。用全基因組啟動(dòng)子區(qū)DNA甲基化芯片(Infinium(?)HumanMehlation450BeadChip,Illumina, USA)對(duì)ARC組與對(duì)照組各10例晶狀體上皮囊膜進(jìn)行檢測(cè)分析,篩選出有差異的由DNA甲基化調(diào)控的與氧化應(yīng)激相關(guān)的基因。再各選取ARC組與對(duì)照組各10例晶狀體上皮囊膜,對(duì)篩選出來(lái)的基因進(jìn)行生物信息學(xué)分析,用DNA甲基化檢測(cè)的金標(biāo)準(zhǔn)方法焦磷酸測(cè)序法進(jìn)行驗(yàn)證。 結(jié)果ARC組中核分級(jí)NC4級(jí)20例,NC5級(jí)7例,NC6級(jí)3例；對(duì)照組均為NC1級(jí)。DNA甲基化芯片篩選結(jié)果顯示,與對(duì)照組相比,ARC組有254個(gè)基因啟動(dòng)子區(qū)DNA甲基化程度顯著上調(diào),有60個(gè)基因啟動(dòng)子區(qū)DNA甲基化程度顯著下調(diào)(P0.001)。差異最大的前30個(gè)基因中CRYAA基因和GJA3基因與氧化應(yīng)激密切相關(guān),且與ARC的發(fā)病密切相關(guān)。CRYAA與GJA3基因啟動(dòng)子區(qū)均存在CpG島,焦磷酸測(cè)序法驗(yàn)證結(jié)果顯示,CRYAA基因啟動(dòng)子區(qū)ARC組的DNA甲基化程度為47.13±3.60%,顯著高于對(duì)照組的35.89±5.88%,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P0.01)；GJA3基因啟動(dòng)子區(qū)ARC組的DNA甲基化程度為3.21±2.40%,顯著高于對(duì)照組的1.80±1.20%,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P0.01)。 結(jié)論本研究通過(guò)DNA甲基化芯片篩選及驗(yàn)證,首次發(fā)現(xiàn)隨著年齡增加,CRYAA及GJA3等氧化應(yīng)激相關(guān)的與白內(nèi)障發(fā)病密切相關(guān)的基因啟動(dòng)子區(qū)DNA甲基化程度增加,說(shuō)明表觀遺傳學(xué)機(jī)制DNA甲基化在ARC的發(fā)病中起到重要作用,為進(jìn)一步研究其作用機(jī)制奠定了基礎(chǔ)。 目的αA晶狀體蛋白(CRYAA基因編碼)具有分子伴侶功能,對(duì)維持晶狀體的透明性起到關(guān)鍵作用；縫隙連接蛋白Cx46(GJA3基因編碼)的廣泛的網(wǎng)絡(luò)作用對(duì)維持晶狀體細(xì)胞間的通訊和分子交換起到重要作用。這兩個(gè)基因均對(duì)維持晶狀體的抗氧化平衡狀態(tài)至關(guān)重要,本研究將探討年齡相關(guān)性核性白內(nèi)障患者CRYAA及GJA3基因啟動(dòng)子區(qū)DNA高甲基化的作用機(jī)制。 材料與方法收集白內(nèi)障手術(shù)中撕下的晶狀體前囊膜12例作為ARC組,入選標(biāo)準(zhǔn)為60歲以上核性ARC患者,LOCS III分級(jí)為NC≥4級(jí)；對(duì)照組選取我院眼庫(kù)中年齡匹配的無(wú)明顯白內(nèi)障的眼球的晶狀體前囊膜12例。取兩組前囊膜各6例提取總RNA,用Real Time RT-PCR法檢測(cè)CRYAA及GJA3基因在mRNA水平的表達(dá)；另取兩組前囊膜各6例提取蛋白,通過(guò)Western blot法分析a A-晶狀體蛋白量和Cx46蛋白量的變化,分析CRYAA及GJA3基因DNA甲基化在mRNA及蛋白水平對(duì)基因表達(dá)的影響。選取CRYAA及GJA3基因焦磷酸測(cè)序結(jié)果DNA甲基化程度兩組間差異最大的CpG位點(diǎn),在體外構(gòu)建該CpG位點(diǎn)甲基化的DNA探針與野生型DNA探針,提取人晶狀體上皮細(xì)胞系SRA01/04的核蛋白,通過(guò)凝膠電泳遷移實(shí)驗(yàn)(EMSA)比較核蛋白與兩種探針的結(jié)合情況,Supershift反應(yīng)比較轉(zhuǎn)錄因子SP1與兩種探針的結(jié)合影響,分析DNA甲基化對(duì)轉(zhuǎn)錄因子調(diào)控的影響。 結(jié)果Real Time RT-PCR結(jié)果顯示ARC組的CRYAA及GJA3基因的mRNA表達(dá)均顯著低于對(duì)照組(p0.01),而Western blot結(jié)果是ARC組的CRYAA及GJA3基因的蛋白表達(dá)量低于對(duì)照組。EMSA結(jié)果顯示CRYAA基因的甲基化DNA探針與核蛋白的結(jié)合低于野生型DNA探針；核蛋白與野生型探針的結(jié)合可被野生型探針競(jìng)爭(zhēng),而不能被甲基化探針競(jìng)爭(zhēng)；Supershift反應(yīng)顯示轉(zhuǎn)錄因子SP1與甲基化DNA探針的結(jié)合低于野生型DNA探針。GJA3的EMSA結(jié)果則為陰性,其甲基化DNA探針與核蛋白的結(jié)合與野生型DNA探針程度無(wú)顯著差異,Supershift反應(yīng)轉(zhuǎn)錄因子SP1與兩種探針的結(jié)合也為無(wú)顯著差異。 結(jié)論CRYAA及GJA3基因啟動(dòng)子區(qū)的DNA高甲基化均影響了基因mRNA及蛋白水平的表達(dá),CRYAA基因的DNA甲基化通過(guò)直接影響基因與轉(zhuǎn)錄因子的結(jié)合而抑制基因轉(zhuǎn)錄,GJA3基因的DNA甲基化并沒(méi)有影響轉(zhuǎn)錄因子的結(jié)合,可能通過(guò)間接途徑影響基因的轉(zhuǎn)錄,其機(jī)制還有待進(jìn)一步進(jìn)行研究。 目的DNA去甲基化藥物Zebularine能抑制晶狀體上皮細(xì)胞的DNMT1酶,抑制MeCp2,進(jìn)而抑制晶狀體上皮細(xì)胞的轉(zhuǎn)化過(guò)程。本研究將探討DNA去甲基化藥物Zebularine對(duì)人晶狀體上皮細(xì)胞的CRYAA及GJA3基因表達(dá)的干預(yù)效果。 材料與方法將永生性人晶狀體上皮細(xì)胞系SRA01/04分為2組,分別加入Zebularine和PBS作為對(duì)照組。培養(yǎng)72小時(shí)后收集細(xì)胞,提取總RNA,用Real Time RT-PCR法檢測(cè)CRYAA及GJA3基因在mRNA水平的表達(dá)；Zebularine干預(yù)后細(xì)胞提取蛋白,通過(guò)Western blot法分析a A-晶狀體蛋白量和Cx46蛋白量的變化。 結(jié)果Zebularine可以有效干預(yù)人晶狀體上皮細(xì)胞CRYAA及GJA3基因的表達(dá)。在mRNA表達(dá)水平,CRYAA及GJA3基因mRNA的表達(dá)量均為對(duì)照組顯著低于Zebularine干預(yù)組,差異均具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P0.05)。在蛋白表達(dá)水平,CRYAA及GJA3基因均為對(duì)照組低于Zebularine干預(yù)組。 結(jié)論DNA去甲基化藥物Zebularine在體外可以有效上調(diào)人晶狀體上皮細(xì)胞CRYAA及GJA3基因的表達(dá),為尋求治療ARC的表觀遺傳學(xué)干預(yù)手段提供了基礎(chǔ)實(shí)驗(yàn)支持。 關(guān)鍵詞Zebularine;人晶狀體上皮細(xì)胞；CRYAA;GJA3
【關(guān)鍵詞】：年齡相關(guān)性白內(nèi)障 氧化應(yīng)激 表觀遺傳學(xué) DNA甲基化 芯片 焦磷酸測(cè)序 CRYAA GJA3 CRYAA GJA3 DNA甲基化 人晶狀體上皮細(xì)胞 EMSA 轉(zhuǎn)錄因子SP1
【學(xué)位授予單位】：復(fù)旦大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2013
【分類號(hào)】：R776.1
【目錄】：

• 英文縮略語(yǔ)5-6
• 中文摘要6-11
• Abstract11-16
• 前言16-21
• 第一部分 DNA甲基化介導(dǎo)的氧化應(yīng)激相關(guān)基因在核性ARC中的篩選及驗(yàn)證21-59
• 引言21-22
• 一、材料與方法22-40
• 1. 材料22-24
• 2. 方法24-40
• 二、結(jié)果40-55
• 1. 晶狀體前囊膜標(biāo)本臨床資料40-41
• 2. DNA甲基化芯片分析41-50
• 3. 氧化應(yīng)激相關(guān)基因的生物信息學(xué)分析50-51
• 4. 焦磷酸測(cè)序驗(yàn)證51-55
• 討論55-59
• 第二部分 DNA甲基化介導(dǎo)的CRYAA及GJA3基因在核性ARC中作用機(jī)制研究59-78
• 引言59-61
• 一、材料與方法61-71
• 1. 材料61-63
• 2. 方法63-71
• 二、結(jié)果71-75
• 1. CRYAA及GJA3基因mRNA表達(dá)水平71-72
• 2. CRYAA及GJA3基因蛋白表達(dá)水平72-73
• 3. CRYAA及GJA3基因轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合分析73-75
• 討論75-78
• 第三部分 DNA去甲基化藥物Zebularine在人晶狀體上皮細(xì)胞中對(duì)CRYAA及GJA3基因表達(dá)的初步干預(yù)研究78-92
• 引言78-80
• 一、材料和方法80-87
• 1. 材料80-81
• 2. 方法81-87
• 二、結(jié)果87-89
• 1. CRYAA及GJA3基因mRNA表達(dá)水平87
• 2. CRYAA及GJA3基因蛋白表達(dá)水平87-89
• 討論89-92
• 全文總結(jié)92-95
• 參考文獻(xiàn)95-106
• 綜述106-123
• 參考文獻(xiàn)118-123
• 在讀期間發(fā)表論文123-124
• 會(huì)議發(fā)言124-125
• 致謝125-127

【參考文獻(xiàn)】

中國(guó)期刊全文數(shù)據(jù)庫(kù) 前1條

1 J.B.Jonas;喻平平;;北京城鄉(xiāng)地區(qū)致盲及視力損害原因的北京眼科研究[J];世界核心醫(yī)學(xué)期刊文摘.眼科學(xué)分冊(cè);2006年11期

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本文編號(hào)：1019713