本文關(guān)鍵詞：ApoG2及聯(lián)合放射治療誘導(dǎo)鼻咽癌CNE-2細(xì)胞凋亡與自噬的研究

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【摘要】：研究背景： 鼻咽癌是一種發(fā)生于鼻咽粘膜上皮細(xì)胞的惡性腫瘤。它的發(fā)生、發(fā)展、臨床表現(xiàn)及治療都與其他頭頸部腫瘤有明顯的區(qū)別。全世界每年約有80,000例新發(fā)鼻咽癌患者,其中男女比例約為2.3：1。在中國(guó)南方及東南亞較為嚴(yán)重,尤其中國(guó)南方每年約有20/100,000新發(fā)病例報(bào)道。它是我國(guó)南部最常見(jiàn)的惡性腫瘤之一。鼻咽癌發(fā)病年齡曲線由20歲開(kāi)始上升,至50-60歲的年齡組達(dá)最高。病理類型以低分化鱗癌為主。主要通過(guò)淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移至頸淋巴結(jié),亦可通過(guò)血液轉(zhuǎn)移至骨、肺、肝。放射治療是其主要治療手段。對(duì)于早、中期患者,放療效果明顯,5年生存率80%。雖然早期放療可以取得滿意的效果,但隨著病變的進(jìn)展30%～40%患者出現(xiàn)遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移和局部復(fù)發(fā)。而且早期發(fā)現(xiàn)困難,患者就診時(shí)多有頸部淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移。在確診的鼻咽癌患者中,約70%為Ⅲ～Ⅳ期預(yù)后較差。對(duì)于這些晚期鼻咽癌則只能采用化療為主的綜合治療,放化療相結(jié)合雖然可以緩解患者病情,但是在臨床治療中常出現(xiàn)對(duì)放化療的抵抗性,并且毒副作用較重。整體治療5年生存率在50%左右。因此需要我們繼續(xù)研究鼻咽癌的發(fā)病機(jī)制,尋找更多更好治療鼻咽癌的方法。 大多數(shù)的腫瘤治療是通過(guò)誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞發(fā)生凋亡來(lái)克服腫瘤的。凋亡是程序性細(xì)胞死亡的一種,即細(xì)胞在特定的內(nèi)源和外緣信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)下,依賴caspase參與,染色質(zhì)凝聚和外周化、細(xì)胞質(zhì)減少、核片段化與細(xì)胞質(zhì)致密化,細(xì)胞皺縮分解成凋亡小體,被鄰近細(xì)胞或巨噬細(xì)胞吞噬清除。近來(lái)發(fā)現(xiàn),程序性細(xì)胞死亡的另一種形式——自噬也在腫瘤發(fā)生、發(fā)展中有著重要的主要。細(xì)胞自噬是不依賴caspase參與,以細(xì)胞內(nèi)雙層膜結(jié)構(gòu)包裹變性壞死的細(xì)胞器或胞漿蛋白形成自噬小體,后被溶酶體分解清除。Bcl-2家族在凋亡過(guò)程中有著重要的作用。Bcl-2家族蛋白作為主要調(diào)控凋亡的蛋白,調(diào)控著細(xì)胞凋亡。近來(lái)有研究表明,凋亡與自噬相互作用,協(xié)同促進(jìn)細(xì)胞死亡。有研究表明,Bcl-2過(guò)表達(dá)能夠抑制自噬的發(fā)生。Bcl-2即能誘導(dǎo)凋亡,又能影響自噬的發(fā)生。Bcl-2引發(fā)的自噬可能與自噬相關(guān)基因Beclinl有關(guān)。Bcl-2蛋白能與Beclinl蛋白的BH3結(jié)構(gòu)域結(jié)合,BH3的類似物能競(jìng)爭(zhēng)性對(duì)抗Beclin1與Bcl-2之間的結(jié)合,能夠使Beclinl釋放出來(lái)促進(jìn)自噬。因此研究靶向Bcl-2治療,誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞發(fā)生凋亡與自噬,抑制腫瘤增殖,是一個(gè)值得研究的課題。 Cleary等研究發(fā)現(xiàn),EB病毒中有一個(gè)開(kāi)放的閱讀框架與Bcl-2基因有同源性,稱作BHRF,它與Bcl-2相似,能夠阻止人與鼠的淋巴細(xì)胞中由于生長(zhǎng)因子缺乏引起的凋亡。EB病毒還能介導(dǎo)內(nèi)源性Bcl-2的表達(dá)而發(fā)揮抑制細(xì)胞凋亡的作用,而后證實(shí),該病毒含有額外的基因,能夠間接地在細(xì)胞中引起B(yǎng)cl-2的反轉(zhuǎn)錄表達(dá),且利用Bcl-2阻止宿主細(xì)胞的凋亡。同樣在Henderson和Sheng分別發(fā)現(xiàn)EB病毒潛伏感染期表達(dá)產(chǎn)物L(fēng)NP1和BARF1能通過(guò)上調(diào)Bcl-2和MCL-1的水平來(lái)保護(hù)宿主細(xì)胞,阻止宿主細(xì)胞發(fā)生凋亡。Song等發(fā)現(xiàn)Bcl-2在鼻咽癌組織中的表達(dá)水平明顯高于癌旁非癌組織和炎性組織。劉陽(yáng)云等人研究發(fā)現(xiàn)在鼻咽癌中Bcl-2陽(yáng)性表達(dá)率高達(dá)82%。因此靶向Bcl-2基因治療鼻咽癌,同樣有著重要的意義。 棉酚(gossypol)是一種從于棉花的莖、葉、種子與根部提取黃色多酚羥基雙萘醛類化合物。棉酚在醫(yī)藥領(lǐng)域最初以醋酸棉酚作為男性避孕藥臨床應(yīng)用多年,近來(lái)研究表明其作為一種新型Bcl-2的小分子阻斷劑,在多種腫瘤中表現(xiàn)出明顯的抗腫瘤活性。Apogossyplone (ApoG2)是去除兩個(gè)醛基后合成的一種新型棉酚衍生物,不但毒性低,副作用小,而且也對(duì)多種腫瘤抑制效果明顯,顯示出了更好的應(yīng)用前景。 研究目的： 本實(shí)驗(yàn)以高表達(dá)Bcl-2的鼻咽癌細(xì)胞株CNE-2為研究對(duì)象,研究ApoG2對(duì)鼻咽癌細(xì)胞系CNE-2細(xì)胞的體外、體內(nèi)生長(zhǎng)抑制作用,誘導(dǎo)細(xì)胞發(fā)生凋亡與自噬現(xiàn)象并初步探討其可能的作用機(jī)制,同時(shí)觀察ApoG2對(duì)人鼻咽癌細(xì)胞系CNE-2細(xì)胞放射治療增敏作用,協(xié)同誘導(dǎo)發(fā)生凋亡與自噬現(xiàn)象及探討其可能作用機(jī)制。為ApoG2的進(jìn)一步研究與臨床應(yīng)用提供實(shí)驗(yàn)依據(jù),并奠定理論基礎(chǔ)。 實(shí)驗(yàn)方法： 1.CCK-8體外增殖法研究ApoG2單藥作用24h、48h和72h對(duì)鼻咽癌細(xì)胞系CNE-2細(xì)胞的體外增殖抑制作用計(jì)算IC50值； 2.CCK-8體外增殖法研究ApoG2聯(lián)合放射治療作用48h對(duì)鼻咽癌細(xì)胞系CNE-2體外增增殖抑制作用； 3. Hoechst33258熒光染色法觀察ApoG2單藥及聯(lián)合放射治療作用于鼻咽癌細(xì)胞系CNE-2后引起的凋亡形態(tài)變化； 4.吖啶橙熒光染色法觀察ApoG2單藥及聯(lián)合放射治療作用于鼻咽癌細(xì)胞系CNE-2后引起的自噬形態(tài)變化； 5.透射電鏡觀察ApoG2作用于鼻咽癌細(xì)胞系CNE-2引起的細(xì)胞超微結(jié)構(gòu)的形態(tài)學(xué)變化情況； 6.流式細(xì)胞儀檢測(cè)ApoG2單藥及聯(lián)合放射治療作用于鼻咽癌細(xì)胞系CNE-2細(xì)胞后引起的細(xì)胞凋亡率及細(xì)胞自噬率的變化情況； 7. Western blot實(shí)驗(yàn)檢測(cè)ApoG2單藥及聯(lián)合放射治療作用于鼻咽癌細(xì)胞系CNE-2細(xì)胞后Bcl-2蛋白及Beclin1蛋白表達(dá)變化； 8.復(fù)制CNE-2鼻咽癌裸鼠模型觀察ApoG2體內(nèi)抑制腫瘤生長(zhǎng)情況。 實(shí)驗(yàn)結(jié)果： 1.通過(guò)CCK-8法體外增殖實(shí)驗(yàn)檢測(cè)顯示濃度分別5、10、20、40、60和80μmol/L的ApoG2作用于人鼻咽癌CNE-2細(xì)胞24h、48h和72h后,均可見(jiàn)對(duì)細(xì)胞具有生長(zhǎng)抑制作用,且具有劑量-時(shí)間依賴性。不同時(shí)間點(diǎn)的抑制率差異比較有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(F=1819.354,P=0.000),作用時(shí)間越長(zhǎng),ApoG2對(duì)細(xì)胞的抑制效應(yīng)越明顯；不同濃度的抑制率差異比較亦有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(F=2041.671,P=0.000),作用濃度越大,ApoG2對(duì)細(xì)胞的抑制效應(yīng)越強(qiáng)。同時(shí)濃度與時(shí)間之間存在交互效應(yīng)(F=202.540,P=0.000)。時(shí)間的延長(zhǎng)和濃度的增加,ApoG2對(duì)人鼻咽癌CNE-2細(xì)胞的抑制率升高。計(jì)算ApoG2在作用72h對(duì)CNE-2細(xì)胞的IC50值為23.61μmol/L。ApoG2聯(lián)合放射治療作用CNE-2細(xì)胞48h,可看出不同放射劑量間比較具有顯著性差異(F=2726.28, P=0.000), ApoG2在不同藥物濃度間比較亦具有顯著性差異(F=4316.28,P=0.000)。兩者之間存在交互效應(yīng)(F=18.54,P=0.000)。 2. Hoechst33258熒光染色法顯示,ApoG2單藥及聯(lián)合放射治療作用于人鼻咽癌CNE-2細(xì)胞48h,鏡下觀察到對(duì)照組細(xì)胞染色質(zhì)均勻,淡藍(lán)色的核形態(tài)規(guī)則的正常細(xì)胞核。ApoG2單藥及聯(lián)合放射治療組均可見(jiàn)明顯核固縮、碎裂,染色質(zhì)凝集、凋亡小體形成等凋亡特征,聯(lián)合放射治療治療組發(fā)現(xiàn)凋亡現(xiàn)象更加明顯。 3.吖啶橙熒光染色法觀察,ApoG2單藥及聯(lián)合放射治療作用于人鼻咽癌CNE-2細(xì)胞48h,對(duì)照組細(xì)胞的胞核與胞質(zhì)呈亮綠色熒光,ApoG2及聯(lián)合放射治療組胞質(zhì)或胞核中酸性自噬泡被染成亮紅色熒光,聯(lián)合放射治療作用組自噬現(xiàn)象更明顯。 4.透射電鏡檢測(cè)可觀察到,ApoG2作用于人鼻咽癌CNE-2細(xì)胞48h,對(duì)照組的人鼻咽癌CNE-2細(xì)胞形態(tài)良好,藥物組(ApoG240μmol/L)的CNE-2細(xì)胞體內(nèi)大空泡增多,多個(gè)散在的膜性雙層結(jié)構(gòu)等細(xì)自體吞噬現(xiàn)象。 5.Flow cytometry (FCM)檢測(cè)凋亡率顯示,ApoG2單藥及聯(lián)合放射治療作用于人鼻咽癌CNE-2細(xì)胞48h,對(duì)照組凋亡率為(3.90±0.34)%,ApoG2(40μmol/L)組為(19.52±1.18)%,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(F=485.294,P=0.000)；對(duì)照組、ApoG2(20μmol/L)單藥組、單純放射治療組及聯(lián)合放射治療組比較,凋亡率組間均數(shù)差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(F=149.511,P=0.000),聯(lián)合作用組與其他三組比較差異均具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P0.05),兩藥聯(lián)合凋亡率更高。 6.FCM檢測(cè)白噬熒光強(qiáng)度顯示,自噬熒光強(qiáng)度為對(duì)照組(0.92±0.31)%,ApoG2(40μmol/L)組為(28.24±7.35)%,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(F=41.354,P=0.003),ApoG2組高于對(duì)照組。 7. Western blot檢測(cè)結(jié)果顯示40μmol/L的ApoG2作用后人鼻咽癌CNE-2細(xì)胞后,Bcl-2蛋白的表達(dá)量較對(duì)照組降低,與對(duì)照組相比差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(F=68.909, P=0.001); Beclinl蛋白表達(dá)量較對(duì)照組增加,與對(duì)照組相比差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(F=497.906,P=0.000)。在聯(lián)合放射治療實(shí)驗(yàn)中,Bcl-2蛋白相對(duì)表達(dá)量,組間均數(shù)差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(F=69.248,P=0.000),聯(lián)合作用組與其他三組比較差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P0.05),聯(lián)合組Bcl-2蛋白的表達(dá)量更低。Beclinl蛋白相對(duì)表達(dá)量,組間均數(shù)差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(F=111.591,P=0.000),聯(lián)合作用組與其他三組比較差異均具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P0.05),聯(lián)合組Beclinl蛋白的表達(dá)量更高。 8.體內(nèi)移植瘤實(shí)驗(yàn)可觀察到,當(dāng)注射藥物第12天時(shí)終止實(shí)驗(yàn),剝離腫瘤,稱量腫瘤重量后,計(jì)算腫瘤抑制率為65.49%,與對(duì)照組比較,治療后腫瘤體重有明顯差異,P0.05。整個(gè)實(shí)驗(yàn)期間,未觀察裸鼠有明顯不良反應(yīng)。按照評(píng)價(jià)標(biāo)準(zhǔn)：腫瘤生長(zhǎng)抑制率40%,為無(wú)效；腫瘤生長(zhǎng)抑制率≥40%,且P0.05為有效。我們認(rèn)為ApoG2能明顯抑制人鼻咽癌CNE-2細(xì)胞體內(nèi)增殖。 實(shí)驗(yàn)結(jié)論： ApoG2在體內(nèi)外可以抑制人鼻咽癌細(xì)系CNE-2細(xì)胞增殖并誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡與自噬發(fā)生程序性細(xì)胞死亡。ApoG2還能增加人鼻咽癌細(xì)系CNE-2細(xì)胞對(duì)放射治療的敏感性,增加細(xì)胞凋亡與自噬現(xiàn)象發(fā)生,協(xié)同抑制腫瘤細(xì)胞增殖。其機(jī)制可能與藥物作用于Bcl-2基因,引起B(yǎng)cl-2表達(dá)下調(diào),誘導(dǎo)Bcl-2途徑細(xì)胞凋亡,同時(shí)Bcl-2蛋白表達(dá)下降,間接減少Bcl-2蛋白與Beclinl蛋白結(jié)合的機(jī)會(huì),能夠使Beclinl蛋白釋放出來(lái),從而促進(jìn)細(xì)胞自噬的發(fā)生,協(xié)同抑制腫瘤的生長(zhǎng)、增殖。
【關(guān)鍵詞】：棉酚 鼻咽癌 放射敏感性 凋亡 自噬
【學(xué)位授予單位】：南方醫(yī)科大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2013
【分類號(hào)】：R739.63
【目錄】：

• 摘要3-8
• ABSTRACT8-16
• 前言16-20
• 第一部分 棉酚衍生物ApoG2誘導(dǎo)鼻咽癌CNE-2細(xì)胞凋亡與自噬及其機(jī)制的探討20-41
• 1 材料與方法20-33
• 2 結(jié)果33-39
• 3 討論39-41
• 第二部分 ApoG2聯(lián)合放射治療誘導(dǎo)鼻咽癌CNE-2細(xì)胞細(xì)胞凋亡與自噬41-53
• 1 材料與方法41-45
• 2 結(jié)果45-50
• 3 討論50-53
• 全文總結(jié)53-54
• 參考文獻(xiàn)54-59
• 附錄：縮略語(yǔ)和中英文對(duì)照表59-60
• 在讀期間論文發(fā)表情況60-61
• 致謝61-63

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