本文關(guān)鍵詞：CEACAM16基因新突變導(dǎo)致遺傳性耳聾的分子機制研究

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【摘要】：研究背景：DFNA4是常染色體顯性遺傳性非綜合征型耳聾的一個基因座位,最初是由于發(fā)現(xiàn)了定位于染色體19q13.33上的MYH14基因突變而被命名。2011年,Zheng J等人首次在美國1070家系中發(fā)現(xiàn)了DFNA4座位上的一個新的致聾基因CEACAM16,并通過生物信息學(xué)分析和體外實驗初步鑒定了CEACAM16基因編碼蛋白的相關(guān)功能。2013年,本研究團隊收集了一個來自中國湖南省五代遺傳的常染色體顯性遺傳家系(SY-026),通過采取傳統(tǒng)的全基因掃描連鎖分析法與最新的外顯子組測序技術(shù)相結(jié)合的策略,發(fā)現(xiàn)了位于CEACAM16基因上的一個新突變位點,即位于4號外顯子上的c.505GA (p.G169R),該突變在家系中共分離,提示其為一個新的CEACAM16基因致聾突變位點。這是世界第二例、國內(nèi)首例CEACAM16基因致聾突變,意義重大。 在本研究中,我們對本研究團隊前期發(fā)現(xiàn)的CEACAM16基因新突變開展了一系列體外實驗,以了解此突變位點對蛋白結(jié)構(gòu)、功能及定位的影響。 目的：觀察CEACAM16基因野生型及其突變型G169R在體外細胞中的表達與定位,以探討該突變可能的致聾機制。 方法：以獲贈質(zhì)粒為模板,構(gòu)建帶C-端Flag的目的真核表達質(zhì)粒pRK5-CEACAM16-Flag (野生型)及pRK5-G169R-Flag(突變型)。將上述構(gòu)建成功的兩種質(zhì)粒瞬時轉(zhuǎn)染293T細胞,48小時后分別提取細胞蛋白及上清蛋白,行Western blot檢測野生及突變蛋白的胞內(nèi)表達量及其各自的胞外分泌情況。細胞免疫熒光檢測野生蛋白和突變蛋白的亞細胞分布情況。 結(jié)果：1.成功構(gòu)建了野生型pRK5-CEACAM16-Flag質(zhì)粒及突變型pRK5-G169R-Flag質(zhì)粒,并經(jīng)雙酶切及測序鑒定。 2.用Western blot檢測CEACAM16野生型及G169R突變型與Flag融合蛋白在293T細胞中的表達,發(fā)現(xiàn)表達后的兩種蛋白分子量大小與預(yù)期相符,存在多聚體形式,且在胞內(nèi)和胞外均可檢測到目的蛋白,但突變蛋白的胞外分泌量較野生蛋白明顯減少。 3.細胞免疫熒光實驗發(fā)現(xiàn),CEACAM16野生蛋白和G169R突變蛋白均主要分布在細胞質(zhì)中,無明顯的區(qū)域聚集現(xiàn)象,且兩者在胞內(nèi)的分布無明顯差異。 結(jié)論：CEACAM16基因的新突變G169R可致突變蛋白的細胞外分泌量減少,但不影響突變蛋白在細胞內(nèi)的分布。
【關(guān)鍵詞】：CEACAM16基因 新突變 分泌蛋白 功能
【學(xué)位授予單位】：中南大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2014
【分類號】：R764.43
【目錄】：

• 摘要5-7
• ABSTRACT7-11
• 中英文~.略詞表11-12
• 前言12-14
• 第一章 CEACAM16野生型基因重組真核細胞表達質(zhì)粒及其突變型的構(gòu)建及鑒定14-37
• 1.1 引言14
• 1.2 材料與方法14-29
• 1.3 結(jié)果29-35
• 1.4 討論35-37
• 第二章 CEACAM16野生型和突變型質(zhì)粒的蛋白表達研究37-53
• 2.1 引言37
• 2.2 材料與方法37-48
• 2.3 結(jié)果48-49
• 2.4 討論49-53
• 第三章 CEACAM16野生型和突變型蛋白亞細胞定位的實驗研究53-61
• 3.1 引言53
• 3.2 材料與方法53-58
• 3.3 結(jié)果58-59
• 3.4 討論59-61
• 第四章 結(jié)論61-62
• 參考文獻62-65
• 綜述65-82
• 參考文獻74-82
• 致謝82-83

【參考文獻】

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本文編號：1008854