本文關鍵詞：GATA4突變p.S335X載體構建及初步功能分析

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【摘要】：目的：GATA4是參與心臟發(fā)育的重要轉錄因子。我們實驗組的前期研究從室間隔缺損(ventricular septal defect, VSD)患者心肌組織中發(fā)現一種特殊類型的突變GATA4 (p.S335X),此突變可使終止密碼子提前產生,導致GATA4的C末端缺失。本課題構建了GATA4野生型(pcDNA6-GATA4-WT, WT)及(p.S335X)突變型(pcDNA6-GATA4-MU, MU)載體,并在小鼠畸胎瘤細胞P19中驗證了轉染、初步考察了細胞凋亡的影響及可能相關的分子機制。方法：利用5'端加酶切位點序列的特異性引物對人源GATA4 cDNA進行聚合酶鏈式反應(polymerase chain reaction, PCR)擴增,分別通過PCR和overlap-PCR得到GATA4編碼全長及覆蓋突變點的相關片段,通過瓊脂糖電泳并回收片段,進行酶切,連接至載體pcDNA6,構建成GATA4WT及MU載體,應用pcDNA6空載(empty vector, E V)質粒作對照。通過測序明確載體序列,對于小鼠畸胎瘤細胞P19進行WT、MU及EV載體的轉染,通過收集轉染后P19細胞的RNA和總蛋白,應用qPCR確定轉染WT及MU載體的P19細胞有大量的GATA4mRNA表達,Western blot鑒定細胞內有GATA4蛋白表達,明確WT及MU載體構建成功。通過TUNEL確定MU對細胞凋亡的基本功能。通過Western blot來初步探索MU參與的相關凋亡分子通路。結果：1.成功構建GATA4WT及MU載體,并通過酶切鑒定、序列檢測、PCR基因鑒定及Westernblot蛋白鑒定。2.初步TUNEL功能分析顯示,與轉染WT的P19細胞比較,轉染MU的P19細胞內可觀察到更明顯的凋亡。3.通過Western blot發(fā)現MU載體在P19中可上調促進凋亡信號Bax,下調抑制凋亡信號Bcl-2,抑制P13K增殖信號通路。結論：1.本課題成功構建了GATA4WT及MU載體；2.在小鼠胚胎細胞P19中,相對于WT, GATA4MU (p.S335X)載體的表達使細胞凋亡增強。3.該突變(p.S335X)參與凋亡通路,可影響經典凋亡通路關鍵蛋白Caspase-3和Caspase-9的表達,使凋亡相關蛋白Bcl-2、Bax、Bim、FoxO3a的表達改變,可能涉及線粒體凋亡途徑。
【關鍵詞】：GATA4基因 突變 載體構建 轉染 P19 TUNEL 凋亡
【學位授予單位】：南京醫(yī)科大學
【學位級別】：碩士
【學位授予年份】：2016
【分類號】：R541.1
【目錄】：

• 中文摘要5-7
• 英文摘要7-9
• 前言9-13
• 材料與方法13-28
• 結果28-35
• 討論35-40
• 結論40-41
• 參考文獻41-55
• 文獻綜述55-70
• 參考文獻63-70
• 中英文縮略詞表70-71
• 攻讀學位期間發(fā)表的論文71-72
• 致謝72

【參考文獻】

中國期刊全文數據庫 前1條

1 ;Mutational screening of affected cardiac tissues and peripheral blood cells identified novel somatic mutations in GATA4 in patients with ventricular septal defect[J];Journal of Biomedical Research;2011年06期

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本文編號：971525