本文關(guān)鍵詞：GATA4突變p.S335X載體構(gòu)建及初步功能分析

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【摘要】：目的：GATA4是參與心臟發(fā)育的重要轉(zhuǎn)錄因子。我們實(shí)驗(yàn)組的前期研究從室間隔缺損(ventricular septal defect, VSD)患者心肌組織中發(fā)現(xiàn)一種特殊類型的突變GATA4 (p.S335X),此突變可使終止密碼子提前產(chǎn)生,導(dǎo)致GATA4的C末端缺失。本課題構(gòu)建了GATA4野生型(pcDNA6-GATA4-WT, WT)及(p.S335X)突變型(pcDNA6-GATA4-MU, MU)載體,并在小鼠畸胎瘤細(xì)胞P19中驗(yàn)證了轉(zhuǎn)染、初步考察了細(xì)胞凋亡的影響及可能相關(guān)的分子機(jī)制。方法：利用5'端加酶切位點(diǎn)序列的特異性引物對(duì)人源GATA4 cDNA進(jìn)行聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(polymerase chain reaction, PCR)擴(kuò)增,分別通過PCR和overlap-PCR得到GATA4編碼全長(zhǎng)及覆蓋突變點(diǎn)的相關(guān)片段,通過瓊脂糖電泳并回收片段,進(jìn)行酶切,連接至載體pcDNA6,構(gòu)建成GATA4WT及MU載體,應(yīng)用pcDNA6空載(empty vector, E V)質(zhì)粒作對(duì)照。通過測(cè)序明確載體序列,對(duì)于小鼠畸胎瘤細(xì)胞P19進(jìn)行WT、MU及EV載體的轉(zhuǎn)染,通過收集轉(zhuǎn)染后P19細(xì)胞的RNA和總蛋白,應(yīng)用qPCR確定轉(zhuǎn)染W(wǎng)T及MU載體的P19細(xì)胞有大量的GATA4mRNA表達(dá),Western blot鑒定細(xì)胞內(nèi)有GATA4蛋白表達(dá),明確WT及MU載體構(gòu)建成功。通過TUNEL確定MU對(duì)細(xì)胞凋亡的基本功能。通過Western blot來初步探索MU參與的相關(guān)凋亡分子通路。結(jié)果：1.成功構(gòu)建GATA4WT及MU載體,并通過酶切鑒定、序列檢測(cè)、PCR基因鑒定及Westernblot蛋白鑒定。2.初步TUNEL功能分析顯示,與轉(zhuǎn)染W(wǎng)T的P19細(xì)胞比較,轉(zhuǎn)染MU的P19細(xì)胞內(nèi)可觀察到更明顯的凋亡。3.通過Western blot發(fā)現(xiàn)MU載體在P19中可上調(diào)促進(jìn)凋亡信號(hào)Bax,下調(diào)抑制凋亡信號(hào)Bcl-2,抑制P13K增殖信號(hào)通路。結(jié)論：1.本課題成功構(gòu)建了GATA4WT及MU載體；2.在小鼠胚胎細(xì)胞P19中,相對(duì)于WT, GATA4MU (p.S335X)載體的表達(dá)使細(xì)胞凋亡增強(qiáng)。3.該突變(p.S335X)參與凋亡通路,可影響經(jīng)典凋亡通路關(guān)鍵蛋白Caspase-3和Caspase-9的表達(dá),使凋亡相關(guān)蛋白Bcl-2、Bax、Bim、FoxO3a的表達(dá)改變,可能涉及線粒體凋亡途徑。
【關(guān)鍵詞】：GATA4基因 突變 載體構(gòu)建 轉(zhuǎn)染 P19 TUNEL 凋亡
【學(xué)位授予單位】：南京醫(yī)科大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2016
【分類號(hào)】：R541.1
【目錄】：

• 中文摘要5-7
• 英文摘要7-9
• 前言9-13
• 材料與方法13-28
• 結(jié)果28-35
• 討論35-40
• 結(jié)論40-41
• 參考文獻(xiàn)41-55
• 文獻(xiàn)綜述55-70
• 參考文獻(xiàn)63-70
• 中英文縮略詞表70-71
• 攻讀學(xué)位期間發(fā)表的論文71-72
• 致謝72

【參考文獻(xiàn)】

中國(guó)期刊全文數(shù)據(jù)庫(kù) 前1條

1 ;Mutational screening of affected cardiac tissues and peripheral blood cells identified novel somatic mutations in GATA4 in patients with ventricular septal defect[J];Journal of Biomedical Research;2011年06期

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本文編號(hào)：971525