本文關(guān)鍵詞：重組組織型纖溶酶原激活劑-RGDS肽融合蛋白的表達、純化及鑒定

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【摘要】：目的 人組織纖溶酶原激活劑(tPA)屬于絲氨酸蛋白酶家族。它能將纖溶酶原轉(zhuǎn)換成纖溶酶,在臨床用于血栓性疾病的治療。通過原核表達和純化重組組織型纖溶酶原激活劑(tPA)-RGDS肽融合蛋白,并初步鑒定其生物學(xué)活性,為靶向性研究奠定基礎(chǔ)。方法 1)設(shè)計引物利用聚合酶鏈式反應(yīng)(PCR)方法使基因重組獲得目的基因片段tPA-RGDS,插入帶有His標簽的高效可溶性表達載體pQE30中,構(gòu)建重組表達質(zhì)粒pQE30-tPA-RGDS;將重組表達質(zhì)粒轉(zhuǎn)化至大腸桿菌(Escherichia coli, E.coli) BL21,經(jīng)自誘導(dǎo)方法誘導(dǎo)目的基因表達；對融合蛋白His-tPA-RGDS用Ni-NTA親和層析柱純化；最后用纖維蛋白平板法評價其生物活性。2)利用PCR方法使基因重組獲得目的基因片段3C-tPA-RGDS,優(yōu)化原核表達條件(表達載體、表達菌、誘導(dǎo)溫度),插入帶有His標簽的原核高效可溶性表達載體pW28中,構(gòu)建重組表達質(zhì)粒pW28-3C-tPA-RGDS,將重組表達質(zhì)粒轉(zhuǎn)化至大腸桿菌Origami 2,經(jīng)自誘導(dǎo)方法誘導(dǎo)目的基因表達；對融合蛋白His-3C-tPA-RGDS用Ni-NTA親和層析柱和DEAE陰離子交換層析柱純化,再用PreScission蛋白酶切3C蛋白從而切除His標簽,用分子篩純化和分析融合蛋白tPA-RGDS聚集狀態(tài),以SDS-PAGE分析其表達量和純度,用Western blot鑒定tPA-RGDS,最后用纖維蛋白平板法評價其生物活性。結(jié)果構(gòu)建重組表達質(zhì)粒pQE30-tPA-RGDS和pW28-3C-tPA-RGDS經(jīng)PCR、雙酶切鑒定及基因測序證實構(gòu)建成功；His-tPA-RGDS和His-3C-tPA-RGDS融合蛋白在大腸桿菌中獲得可溶性上清表達；His-3C-tPA-RGDS融合蛋白在原核表達體系(pW28載體、Origami 2菌株及37℃誘導(dǎo)溫度)得到了最優(yōu)的表達；通過PreScission蛋白酶成功去除His標簽,得到tPA-RGDS融合蛋白,SDS-PAGE顯示其相對分子質(zhì)量約為70000 Da,分子篩顯示其在溶液中以單聚體形式存在；從上清中獲得了純度較高的tPA-RGDS融合蛋白,體外實驗顯示其纖溶活性為2.5×105IU/mg。結(jié)論1)首次使重組組織型纖溶酶原激活劑通過自誘導(dǎo)方法得到可溶性表達,為tPA工業(yè)和制藥水平發(fā)展提供了有價值的信息；2)獲得了純度和活性較高的tPA-RGDS融合蛋白,為下一步進行融合蛋白的靶向性研究奠定了基礎(chǔ)。
【關(guān)鍵詞】：重組組織型纖溶酶原激活劑 RGDS 原核表達 自誘導(dǎo) 靶向性
【學(xué)位授予單位】：重慶醫(yī)科大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2015
【分類號】：R54
【目錄】：

• 英漢縮略語名詞對照5-6
• 中文摘要6-8
• 英文摘要8-11
• 前言11-13
• 第一章 His-tPA-RGDS融合蛋白的表達、純化及鑒定13-22
• 1 材料與方法13-19
• 2 實驗結(jié)果19-21
• 3 討論21-22
• 第二章 tPA-RGDS融合蛋白的表達、純化及功能鑒定22-38
• 第一節(jié) 重組表達菌構(gòu)建、優(yōu)化及表達22-31
• 1 材料與方法22-26
• 2 實驗結(jié)果26-30
• 3 討論30-31
• 第二節(jié) tPA-RGDS融合蛋白的純化及鑒定31-38
• 1 材料與方法31-34
• 2 實驗結(jié)果34-36
• 3 討論36-38
• 全文總結(jié)38-39
• 參考文獻39-43
• 文獻綜述43-50
• 參考文獻47-50
• 致謝50-51
• 發(fā)表的論文、參加的學(xué)術(shù)會議及參與的科研項目51

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本文編號：925425