本文關(guān)鍵詞：wnt5b誘導(dǎo)大鼠骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞向心肌樣細(xì)胞分化的實驗研究

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【摘要】：目的:心肌梗死的致殘致死率極高,已成為危及生命的重大疾病,現(xiàn)有的治療手段難以從根本上解決問題;干細(xì)胞治療心肌梗死的前景相當(dāng)廣闊,但仍存在諸多問題,例如:移植后干細(xì)胞分化率較低、存活率低等。本研究擬通過調(diào)節(jié)wnt5b基因的表達(dá),探討B(tài)MSCs向心肌樣細(xì)胞分化率的改變,旨在為臨床心肌梗死的治療提供更有效的方法。方法:選取4周齡SD大鼠脛骨提取骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞,利用貼壁法培養(yǎng),傳代生長到P3代,以流式細(xì)胞儀檢測細(xì)胞表面抗原,主要選用CD29、CD 44、CD 34、CD 45鑒定骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞。選取生長良好的P3代骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞分為四個實驗組,分別轉(zhuǎn)染si RNA-空白對照(si RNA-NC)、wnt5b基因沉默組(si RNA-wnt5b)、PEX1-空白對照(PEX1-NC)、wnt5b基因高表達(dá)組(PEX1-wnt5b),從而實現(xiàn)對wnt5b基因沉默及高表達(dá),24h后向每組細(xì)胞內(nèi)加入心肌細(xì)胞裂解液誘導(dǎo)分化。在體外,于3天、7天、14天收取細(xì)胞,以q PCR檢測各組細(xì)胞心肌特異性因子Nkx2.5、GATA-4、CX43、Myo D的m RNA量;以免疫熒光檢測各組細(xì)胞中的特異性CX43、Desmin表達(dá),比較各組熒光亮度;以蛋白印跡法(western blot,WB)檢測各組細(xì)胞Desmin、c Tn T蛋白表達(dá)量,比較各組特異蛋白表達(dá)的變化。在體內(nèi),建立大鼠心梗模型,48h后注射四組處理后的細(xì)胞,分別于術(shù)后第1、28天心超檢測大鼠心功能指標(biāo),28天后取出心臟行HE染色,Masson染色,免疫熒光等檢測心肌分化指標(biāo)。結(jié)果:貼壁法分離得到P3代BMSCs,鏡下觀察細(xì)胞長條狀,呈極性生長,流式鑒定細(xì)胞表面抗原CD29、CD 44陽性,CD 34、CD 45陰性。處理后3天q PCR檢測心肌特異性因子,si RNA-wnt5b組Nkx2.5、GATA-4表達(dá)量升高,而PEX1-wnt5b組Nkx2.5、GATA-4表達(dá)受到抑制,與對應(yīng)的陰性對照組相比有統(tǒng)計學(xué)差異;si RNA-wnt5b組CX43、Myo D表達(dá)量下降,而PEX1-wnt5b組CX43、Myo D表達(dá)略升高,與對應(yīng)的陰性對照組相比無統(tǒng)計學(xué)差異。處理后7天、14天q PCR檢測心肌特異性因子,si RNA-wnt5b組Nkx2.5、GATA-4、CX43、Myo D表達(dá)量升高,而PEX1-wnt5b組Nkx2.5、GATA-4、CX43、Myo D表達(dá)受到抑制,與對應(yīng)的陰性對照組相比有統(tǒng)計學(xué)差異。體外免疫熒光檢測心肌特異性蛋白CX43、Desmin,western blot檢測Desmin、c Tn T蛋白表達(dá),si RNA-wnt5b組表達(dá)增高,PEX1-wnt5b組表達(dá)降低。建立心梗模型,向梗死心肌表面注射處理后的BMSCs,轉(zhuǎn)染si RNA-wnt5b組大鼠心功能較轉(zhuǎn)染PEX1-wnt5b組明顯修復(fù);Masson染色分析心梗面積發(fā)現(xiàn):si RNA-wnt5b組梗死纖維組織面積最小,而PEX1-wnt5b組梗死纖維組織面積最大,與相應(yīng)的陰性對照組比較有統(tǒng)計學(xué)差異;HE染色可見si RNA-wnt5b組較PEX1-wnt5b組心肌細(xì)胞排列整齊,炎癥細(xì)胞浸潤減少;最后對注射BMSCS的心臟組織進(jìn)行免疫熒光檢測,CX43在si RNA-wnt5b組表達(dá)增高,而PEX1-wnt5b組表達(dá)降低。結(jié)論:wnt5b在BMSCs向心肌樣細(xì)胞分化中有重要的調(diào)控作用,上調(diào)wnt5b抑制BMSCs向心肌樣細(xì)胞分化,下調(diào)wnt5b則促進(jìn)其分化;wnt5b可能是通過改變GSK-3β的表達(dá),調(diào)控BMSCs向心肌樣細(xì)胞分化。
【關(guān)鍵詞】：骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞 分化 心肌樣細(xì)胞 wnt5b
【學(xué)位授予單位】：蘇州大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2015
【分類號】：R542.22
【目錄】：

• 中文摘要4-6
• Abstract6-10
• 前言10-13
• 第一部分 SD大鼠骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞及心肌細(xì)胞培養(yǎng)13-17
• 一、材料13-14
• 二、方法14-15
• 三、結(jié)果15-17
• 第二部分 wnt5b過表達(dá)質(zhì)粒構(gòu)建17-23
• 一、材料17-18
• 二、方法18-20
• 三、結(jié)果20-23
• 第三部分 wnt5b影響大鼠骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞向心肌樣細(xì)胞分化的體外研究23-39
• 第一節(jié) 轉(zhuǎn)染wnt5b過表達(dá)質(zhì)粒及wnt5b-siRNA檢測心肌特異性因子表達(dá)23-30
• 一、材料23
• 二、方法23-27
• 三、結(jié)果27-30
• 第二節(jié) 心肌特異性因子的免疫熒光檢測30-35
• 一、材料30-31
• 二、方法31
• 三、結(jié)果31-35
• 第三節(jié) Western-blot法檢測心肌特異性蛋白的表達(dá)35-39
• 一、材料35
• 二、方法35-37
• 三、結(jié)果37-39
• 第四部分 wnt5b影響大鼠骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞向心肌樣細(xì)胞分化的體內(nèi)研究39-48
• 一、材料39-40
• 二、方法40-42
• 三、結(jié)果42-48
• 討論48-53
• 結(jié)論53-54
• 參考文獻(xiàn)54-60
• Review60-84
• 參考文獻(xiàn)72-84
• 英漢雙解縮略詞表84-85
• 攻讀學(xué)位期間發(fā)表的論文85-86
• 致謝86-88

【參考文獻(xiàn)】

中國期刊全文數(shù)據(jù)庫 前5條

1 陳嘉;孫京臣;鄒移海;張進(jìn);黃冰;;丹酚酸B誘導(dǎo)骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞向心肌樣細(xì)胞分化[J];第四軍醫(yī)大學(xué)學(xué)報;2007年23期

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本文編號：900331