本文關(guān)鍵詞：SOCS1介導(dǎo)AngⅡ促血管平滑肌細胞增殖的作用及機制

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【摘要】：目的:探討細胞因子信號轉(zhuǎn)導(dǎo)抑制因子-1(suppressor of cytokine signal1ing-1,SOCS1)對血管緊張素II(AngiotensinⅡ,AngⅡ)誘導(dǎo)的人血管平滑肌細胞(vascular smooth muscle cell,VSMC)增殖的影響及可能的機制。方法:1)以人臍動脈血管平滑肌細胞(VSMC)為研究對象,建立AngⅡ促VSMC增殖模型。用0mol/L、10-8mol/L、10-7mol/L、10-6mol/L、10-5mol/L等不同終濃度的AngⅡ孵育細胞48h,行MTT檢測,得出作用最明顯的濃度,以該濃度AngⅡ孵育細胞0h、12h、24h、48h、72h,行MTT檢測,得出最佳作用時間。2)最佳作用濃度AngⅡ分別刺激VSMC 0h、12h、24h、48h、72h,DCFH-DA探針檢測活性氧(reactive oxygen species,ROS)水平,Western-blot檢測SOCS1表達情況。3)設(shè)計與合成3對靶向人SOCS1基因的si RNA(SOCS1-si RNA),實時熒光定量-PCR和Western-blot篩選最佳SOCS1-si RNA。4)用陽離子脂質(zhì)體將最佳SOCS1-si RNA轉(zhuǎn)染VSMC,給予AngⅡ孵育。實驗作2個分組:實驗1:空白對照組、SOCS1-si RNA組、AngⅡ組、AngⅡ+SOCS1-si RNA組、Ly294002組、Ly294002+AngⅡ組;(Ly294002為Akt信號通路阻斷劑)實驗2:空白對照組、SOCS1-si RNA組、天然維生素E組、AngⅡ組、AngⅡ+SOCS1-si RNA組、、天然維生素E+AngⅡ組。(天然維生素E為ROS清除劑)5)用MTT比色法檢測細胞增殖活力,流式細胞術(shù)檢測細胞凋亡率,DCFH-DA探針法檢測細胞內(nèi)活性氧(ROS)水平,Western-blot技術(shù)分別測定SOCS1、凋亡相關(guān)基因Bax和Bcl-2、Akt信號通路蛋白總Akt、p-Akt的表達。6)數(shù)據(jù)以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(sx±)表示,用SPSS 17.0軟件分析數(shù)據(jù),P0.05認為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。結(jié)果:1)10-8mol/L、10-7mol/L、10-6mol/L、10-5mol/L的AngⅡ均可促進VSMC增殖,其中10-7mol/L濃度的AngⅡ作用最明顯;用10-7mol/L的AngⅡ刺激VSMC0h、12h、24h、48h、72h,其促增殖的作用在48h內(nèi)表現(xiàn)為時間依賴性,刺激72h時的其促增殖作用與48h無明顯差異。選取10-7mol/L的AngⅡ刺激VSMC48h用于后續(xù)實驗。2)AngⅡ促進VSMC內(nèi)ROS生成及SOCS1表達。3)成功設(shè)計并篩選出一對能夠有效沉默SOCS1表達的SOCS1-si RNA3。4)與空白對照組相比,AngⅡ組細胞增殖率明顯增加(P0.01),SOCS1-si RNA、Ly294002組VSMC增殖率下降(P0.01),凋亡率明顯上升(P0.05);SOCS1-si RNA、Ly294002對VSMC生存的影響效果相似(P0.05);SOCS1-si RNA+AngⅡ組、Ly294002+AngⅡ組細胞增殖率與AngⅡ組相比明顯下降(P0.01),凋亡率與空白對照組相比無明顯差異(P0.05),兩者之間的存活率相比較無統(tǒng)計學(xué)差異(P0.05)。5)與空白對照組相比,SOCS1-si RNA組的SOCS1蛋白的表達明顯降低(P0.01)、Bax/Bcl2比值增大(P0.01),AngⅡ組Bax/Bcl2比值減小(P0.05);與AngⅡ組相比,SOCS1-si RNA+AngⅡ組的SOCS1蛋白表達減少(P0.01)、Bax/Bcl2比值增大(P0.01);與空白對照組相比,Ly294002組SOCS1蛋白表達差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P0.05),而Bax/Bcl2比值增大(P0.01);與Ly294002組相比,Ly294002+AngⅡ組的Bax/Bcl2比值明顯減小(P0.01)。6)各個實驗組的總Akt蛋白表達差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P0.05);與空白對照組相比,AngⅡ組p-Akt蛋白表達增加(P0.05)、SOCS1-si RNA組、Ly294002組p-Akt表達明顯下降(P0.01),并且后兩者p-Akt蛋白無明顯差異(P0.05);與AngⅡ組相比,SOCS1-si RNA+AngⅡ組、Ly294002+AngⅡ組p-Akt表達減少(p0.05),且這兩組相互之間的p-Akt蛋白的差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P0.05)。7)與空白對照組相比,SOCS1-si RNA組平均熒光強度(mean fluorescence intensity,MFI)減低(P0.05)、細胞增殖率下降(P0.05)、凋亡率上升(P0.01),AngⅡ組MFI明顯增強(P0.01)、增殖率明顯增加(P0.01),凋亡率無明顯變化(P0.05),天然維生素E組MFI、增殖率、凋亡率變化無統(tǒng)計學(xué)意義(P0.05);與AngⅡ組相比,SOCS1-si RNA+AngⅡ組、天然維生素E+AngⅡ組的MFI明顯降低(P0.01),增殖率下降(P0.01),凋亡率變化無統(tǒng)計學(xué)意義(P0.05)。結(jié)論:1)RNA干擾可以有效的抑制SOCS1在臍動脈血管平滑肌細胞中的表達。2)SOCS1表達下調(diào)可以有效地抑制AngⅡ誘導(dǎo)的血管平滑肌細胞增殖,SOCS1介導(dǎo)了AngⅡ促血管平滑肌細胞增殖的作用。3)SOCS1介導(dǎo)AngⅡ促血管平滑肌細胞增殖的作用與細胞內(nèi)Bax/Bcl2比值變化有關(guān)。4)Akt信號通路和ROS可能參與了SOCS1介導(dǎo)的AngⅡ促血管平滑肌細胞增殖。
【關(guān)鍵詞】：血管平滑肌細胞 SOCS1 血管緊張素II
【學(xué)位授予單位】：南昌大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2015
【分類號】：R543.5
【目錄】：

• 摘要3-6
• ABSTRACT6-11
• 第1章 引言11-13
• 第2章 材料與方法13-31
• 2.1 材料13-19
• 2.1.1 細胞株13
• 2.1.2 購置試劑13-14
• 2.1.3 自配試劑14-17
• 2.1.4 主要儀器設(shè)備及耗材17-19
• 2.2 方法19-30
• 2.2.1 細胞培養(yǎng)19-20
• 2.2.2 建立AngⅡ促血管平滑肌細胞增殖模型20-21
• 2.2.3 DCFH-DA探針測定細胞ROS水平21
• 2.2.4 SOCS1-siRNA的設(shè)計、合成及篩選21-23
• 2.2.5 血管平滑肌細胞的轉(zhuǎn)染及AngⅡ作用23-24
• 2.2.6 MTT法測定細胞活力24
• 2.2.7 流式細胞儀檢測細胞凋亡率24
• 2.2.8 熒光定量PCR（qPCR）法檢測SOCS1的表達24-27
• 2.2.9 Western-blot檢測SOCS1、Bax、Bcl2、總Akt、p-Akt（Ser473）蛋白的表達27-30
• 2.2.10 活性氧的檢測30
• 2.3.統(tǒng)計學(xué)處理30-31
• 第3章 實驗結(jié)果31-40
• 3.1 臍動脈血管平滑肌細胞形態(tài)31
• 3.2 AngⅡ?qū)ρ芷交〖毎鲋秤绊?/span>31-32
• 3.3 AngⅡ?qū)ρ芷交〖毎麅?nèi)ROS水平、SOCS1表達的影響32-33
• 3.4 SOCS1-siRNA的篩選33-35
• 3.4.1 轉(zhuǎn)染條件的優(yōu)化33
• 3.4.2 qPCR法和Western-blot分析3對SOCS1-siRNA序列對SOCS1基因表達的抑制作用33-35
• 3.5 SOCS1-siRNA對VSMC存活率和凋亡率的影響35-36
• 3.6 AngⅡ、SOCS1-si RNA及Ly294002對凋亡相關(guān)基因表達的影響36
• 3.7 SOCS1-siRNA對Akt信號通路的影響36-38
• 3.8 ROS對SOCS1-siRNA抑制AngⅡ誘導(dǎo)的VSMC增殖的影響38-40
• 3.8.1 SOCS1-siRNA對AngⅡ誘導(dǎo)的ROS生成的影響38
• 3.8.2 ROS的變化對VSMC存活率及凋亡的影響38-40
• 第4章 討論40-44
• 第5章 結(jié)論與展望44-45
• 5.1 結(jié)論44
• 5.2 進一步工作的方向44-45
• 致謝45-46
• 參考文獻46-48
• 攻讀學(xué)位期間的研究成果48-49
• 綜述49-56
• 參考文獻54-56

【參考文獻】

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本文編號：892607