本文關鍵詞：中國西南地區(qū)原發(fā)性心肌病與線粒體基因改變的相關性研究

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【摘要】：目的:擴張型心肌病(Dilated Cardiomyopathy,DCM)、肥厚型心肌病(Hypertrophic Cardiomyopathy,HCM)是原發(fā)性心肌病中最常見的兩類,均屬于遺傳性心肌病范疇,具有明顯的遺傳學背景。目前研究已經發(fā)現超過30種基因與DCM相關,超過20種基因,1400余種突變與HCM相關。由于心臟對氧化代謝具有特殊的依賴,線粒體作為氧化磷酸系統(tǒng)(oxidative Phosphorylation,OXPHOS)產能的關鍵,其結構和功能改變在心臟受損中的作用越來越受到關注。迄今為止,超過300個致病線粒體基因(mt DNA)點突變被發(fā)現,包括蛋白編碼基因、t RNA基因、r RNA基因,并且最常見于線粒體t RNA(mt t RNA)與線粒體蛋白編碼基因cytb(mt cytb)中。由于中國對線粒體基因突變報道較少,故中國西南地區(qū)、乃至中國人群是否存線粒體基因突變或多態(tài)性,突變與多態(tài)性是否與原發(fā)性心肌病(DCM、HCM)相關,尚無足夠證據。故本實驗篩選線粒體基因組中最易致變的mt cytb、mt t RNA中的Gln、Ile、Leu、Lys、Pro、Val、Ser七個基因來尋找我國DCM、HCM是否存在線粒體基因突變或多態(tài)性,并對比其是否為突變熱點或新發(fā)突變,探討線粒體基因改變在中國西南地區(qū)患者中的發(fā)病狀況,并分析其與這兩種心肌疾病發(fā)病的相關性,進而為我國西南地區(qū)漢族人群線粒體基因與原發(fā)性心肌病的遺傳相關性研究提供更多的證據及方向,并有可能為將來的基因治療提供理論依據。方法:研究對象選取中國西南地區(qū)的漢族人群,其中DCM患者120例,明確家系1例;HCM患者65例,明確家系2例;健康對照者200例。研究對象均行超聲心動圖、心電圖檢查,對家系繪制遺傳圖譜。研究采用病例對照研究,將mt cytb、mt t RNA Gln、mt t RNA Ile、mt t RNA Leu、mt t RNA Lys、mt t RNA Pro、mt t RNA Val、mt t RNA Ser整個基因序列作為擴增的目的序列,采用DNA試劑盒從患者和健康對照者外周血中提取DNA作為擴增的模板,用primer primer 5軟件設計特異性引物、聚合酶鏈擴增反應(Polymerase chain reaction,PCR)擴增目的序列,擴增產物行瓊脂糖凝膠電泳、Goldview染色技術、紫外線分光儀測量、凝膠成像、Sanger雙脫氧鏈終止法測定所有擴增產物的堿基序列,分析所得的序列圖,并將測得堿基序列同線粒體數據庫中上述基因的全基因序列進行比對,得出與DCM或HCM相關的多態(tài)(Single Nucleotide Polymorphisms,SNP)或突變位點,計算SNP在患者與健康對照者間的頻率,用獨立樣本t檢驗比較患者與健康對照者之間多態(tài)位點頻率的統(tǒng)計學差異。突變點與200例健康對照者進行序列比對及分析;對臨床伴發(fā)聽力障礙的早發(fā)DCM家系直接行線粒體全基因組測序及分析。結果:1.研究對象臨床特點分析:HCM患者心肌明顯增厚,多數患者伴輕度心功能不全,心電圖改變以T波改變?yōu)橹�。DCM患者全心明顯增大,左心功能明顯降低,多數患者心功能為中-重度心功能不全(根據NYHA分期),心電圖改變以QRS增寬為主。2.HCM患者線粒體基因分析結果:①在mt t RNA Gln基因上發(fā)現1個突變位點(m.4395AG),發(fā)現于HCM家系2;HCM家系1、其余HCM患者、DCM患者及200例健康對照者中無此位點改變。此位點堿基由A突變?yōu)镚,突變位置位于mt t RNA Gln外顯子,屬于Gln的功能保守區(qū),突變類型為點突變。此位點的突變與突尼斯一散發(fā)HCM患者的發(fā)現一致,該突變導致mt t RNA Gln結構改變,影響蛋白質翻譯過程,為致病性突變的可能極大。②HCM家系1未發(fā)現上述基因突變,也未發(fā)現mt cytb、mt t RNA Ile、mt t RNA Leu、mt t RNA Lys、mt t RNA Pro、mt t RNA Val、mt t RNA Ser基因的突變或多態(tài)位點。③其余HCM患者均未發(fā)現mt cytb、mt t RNA Gln、mt t RNA Ile、mt t RNA Leu、mt t RNA Lys、mt t RNA Pro、mt t RNA Val、mt t RNA Ser基因的突變或多態(tài)位點。3.DCM患者基因分析結果:①通過與線粒體db SNPC數據庫比對(線粒體參考基因組版“NC-012920.1”),在中國西南地區(qū)人群中發(fā)現了線粒體5個mt cytb基因多態(tài)位點,分別為:m.14766CG(rs527236041)、m.14783CT(rs527236042)、m.15043GA(rs527236043)、m.15301AG(rs527236045)、m.15326 AG(rs2853508)。mt cytb基因位于線粒體基因組第14747-15887位,整個序列均為外顯子,m.15043GA、m.15301AG、m.15326 AG三個位點位于其功能保守區(qū),目前國內外均無m.15043GA、m.15301AG兩個位點與HCM、DCM相關的報道,m.14766CG、m.15326 AG兩個位點與丹麥人群HCM多態(tài)位點一致,m.15043GA與美國人群DCM中多態(tài)位點一致。②分別計算mt cytb基因5個多態(tài)位點在DCM患者和健康對照者中的頻率,用SPSS19對二者頻率行兩獨立樣本t檢驗,檢驗有統(tǒng)計學差異(P0.05);并且上述多態(tài)位點在DCM患者中的頻率明顯高于健康對照者。由于線粒體遺傳遵循嚴格的母系遺傳和遺傳瓶頸作用,故其不適用于Hardy-Weinberg平衡及其檢驗,本實驗結果具有患者人群代表性。③在DCM患者mt cytb基因中發(fā)現5個新發(fā)突變位點,分別是m.15263CT、m.15290CA、m.15330TG、m.15338CG、m.15386TG,并且上述位點均位于mt cytb外顯子與它的功能保守區(qū)。200例健康對照者無上述位點變化。上述突變均為單個堿基的點突變,并造成對應氨基酸的改變,突變位點測序圖無雜帶出現。④DCM家系患者均伴發(fā)聽力障礙的兒童患者,本研究對此家系行線粒體全基因組測序,檢測結果發(fā)現在mt t RNA Glu基因上存在突變位點:m.14696AG,本研究所有HCM患者、其余DCM患者和200例健康對照者中均無此位點改變。此位點堿基由A突變?yōu)镚,測序結果分析得突變率為95.98%,突變類型為點突變。芬蘭人群曾報道同一突變與線粒體腦肌病相關,但此突變未發(fā)現與原發(fā)性心肌病相關。⑤中國西南地區(qū)DCM患者未發(fā)現mt t RNA Gln、mt t RNA Ile、mt t RNA Leu、mt t RNA Lys、mt t RNA Pro、mt t RNA Val、mt t RNA Ser基因的突變或多態(tài)位點。結論:1.本研究對象臨床特點表明我國西南地區(qū)HCM、DCM患者以心力衰竭和心律失常為主要臨床表現,多數患者呈散發(fā)性,部分呈家族遺傳性。2.我國西南地區(qū)漢族人群HCM與線粒體基因改變相關性分析:①在我國西南地區(qū)HCM家系患者中存在與突尼斯患者相同的線粒體基因突變位點(mt t RNA Gln 4395AG),已證實該突變位點與HCM發(fā)病具有顯著的相關性,在中國人遺傳背景下其可能是家族性HCM(Familiar Hypertrophic Cardiomyopathy,FHCM)發(fā)現的致病基因之一。②我國西南地區(qū)漢族人群HCM可能不存在mt cytb、mt t RNA Ile、mt t RNA Leu、mt t RNA Lys、mt t RNA Pro、mt t RNA Val、mt t RNA Ser基因的突變或多態(tài)性。3.我國西南地區(qū)漢族人群DCM與線粒體基因改變相關性分析:①首次在中國西南地區(qū)漢族人群DCM中發(fā)現了線粒體5個mt cytb基因多態(tài)位點,其中m.15043GA、m.15301AG、m.15326 AG為新發(fā)的多態(tài)位點,可以作為我國DCM和mt cytb多態(tài)位點分析時的一個遺傳建議;m.14766CG、m.15326 AG兩個多態(tài)位點屬HCM、DCM的共同多態(tài)位點,表明線粒體基因多態(tài)性也具有遺傳異質性的特點。②位于mt cytb基因的五個多態(tài)位點在DCM患者中的頻率明顯高于健康對照者,說明本研究發(fā)現的五個多態(tài)位點與我國西南地區(qū)DCM發(fā)病存相關性。③在mt cytb基因中發(fā)現了5個新發(fā)突變,測序圖提示突變均屬純合突變,位于保守區(qū)的這五個突變位點極大可能通過影響氧化磷酸化、呼吸鏈的形成,降低ATP生成、引起線粒體功能障礙而與DCM相關。④我國西南地區(qū)漢族人群DCM患者與mt t RNA Glu14696AG突變相關,該新發(fā)突變與我國DCM患者發(fā)病相關,結合芬蘭研究結果,我們推測該突變位點可能是DCM與線粒體腦肌病所共有;同時分析該突變來源的患者臨床特點,推測該突變也可能是伴發(fā)聽力障礙的早發(fā)DCM患者的致病基因之一。此外,在遺傳特性明顯的家族性DCM中線粒體基因突變具有明顯的閾值效應。⑤我國西南地區(qū)漢族人群DCM可能不存在mt t RNA Gln、mt t RNA Ile、mt t RNA Leu、mt t RNA Lys、mt t RNA Pro、mt t RNA Val、mt t RNA Ser基因的突變或多態(tài)性。
【關鍵詞】：擴張型心肌病 肥厚型心肌病 遺傳 基因突變 單核苷酸多態(tài)性(SNP) 線粒體tRNA(mt tRNA)、線粒體cytb(mt cytb)
【學位授予單位】：四川醫(yī)科大學
【學位級別】：碩士
【學位授予年份】：2015
【分類號】：R542.2
【目錄】：

• 中文摘要3-8
• 英文摘要8-15
• 前言15-17
• 材料與方法17-31
• 結果31-45
• 討論45-57
• 結論57-58
• 參考文獻58-64
• 英漢縮略詞對照表64-66
• 致謝66-67
• 心肌病中線粒體tRNA突變的研究進展（綜述）67-78
• 參考文獻74-78
• 攻讀碩士學位期間發(fā)表論文及參與科研項目78-80

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1 周憲春;金東洙;;線粒體DNA變異與疾病關系相關性研究[J];現代醫(yī)藥衛(wèi)生;2007年15期

2 唐t，

本文編號：878867