本文關(guān)鍵詞：中國西南地區(qū)原發(fā)性心肌病與線粒體基因改變的相關(guān)性研究

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【摘要】：目的:擴(kuò)張型心肌病(Dilated Cardiomyopathy,DCM)、肥厚型心肌病(Hypertrophic Cardiomyopathy,HCM)是原發(fā)性心肌病中最常見的兩類,均屬于遺傳性心肌病范疇,具有明顯的遺傳學(xué)背景。目前研究已經(jīng)發(fā)現(xiàn)超過30種基因與DCM相關(guān),超過20種基因,1400余種突變與HCM相關(guān)。由于心臟對氧化代謝具有特殊的依賴,線粒體作為氧化磷酸系統(tǒng)(oxidative Phosphorylation,OXPHOS)產(chǎn)能的關(guān)鍵,其結(jié)構(gòu)和功能改變在心臟受損中的作用越來越受到關(guān)注。迄今為止,超過300個致病線粒體基因(mt DNA)點(diǎn)突變被發(fā)現(xiàn),包括蛋白編碼基因、t RNA基因、r RNA基因,并且最常見于線粒體t RNA(mt t RNA)與線粒體蛋白編碼基因cytb(mt cytb)中。由于中國對線粒體基因突變報道較少,故中國西南地區(qū)、乃至中國人群是否存線粒體基因突變或多態(tài)性,突變與多態(tài)性是否與原發(fā)性心肌病(DCM、HCM)相關(guān),尚無足夠證據(jù)。故本實(shí)驗(yàn)篩選線粒體基因組中最易致變的mt cytb、mt t RNA中的Gln、Ile、Leu、Lys、Pro、Val、Ser七個基因來尋找我國DCM、HCM是否存在線粒體基因突變或多態(tài)性,并對比其是否為突變熱點(diǎn)或新發(fā)突變,探討線粒體基因改變在中國西南地區(qū)患者中的發(fā)病狀況,并分析其與這兩種心肌疾病發(fā)病的相關(guān)性,進(jìn)而為我國西南地區(qū)漢族人群線粒體基因與原發(fā)性心肌病的遺傳相關(guān)性研究提供更多的證據(jù)及方向,并有可能為將來的基因治療提供理論依據(jù)。方法:研究對象選取中國西南地區(qū)的漢族人群,其中DCM患者120例,明確家系1例;HCM患者65例,明確家系2例;健康對照者200例。研究對象均行超聲心動圖、心電圖檢查,對家系繪制遺傳圖譜。研究采用病例對照研究,將mt cytb、mt t RNA Gln、mt t RNA Ile、mt t RNA Leu、mt t RNA Lys、mt t RNA Pro、mt t RNA Val、mt t RNA Ser整個基因序列作為擴(kuò)增的目的序列,采用DNA試劑盒從患者和健康對照者外周血中提取DNA作為擴(kuò)增的模板,用primer primer 5軟件設(shè)計(jì)特異性引物、聚合酶鏈擴(kuò)增反應(yīng)(Polymerase chain reaction,PCR)擴(kuò)增目的序列,擴(kuò)增產(chǎn)物行瓊脂糖凝膠電泳、Goldview染色技術(shù)、紫外線分光儀測量、凝膠成像、Sanger雙脫氧鏈終止法測定所有擴(kuò)增產(chǎn)物的堿基序列,分析所得的序列圖,并將測得堿基序列同線粒體數(shù)據(jù)庫中上述基因的全基因序列進(jìn)行比對,得出與DCM或HCM相關(guān)的多態(tài)(Single Nucleotide Polymorphisms,SNP)或突變位點(diǎn),計(jì)算SNP在患者與健康對照者間的頻率,用獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)比較患者與健康對照者之間多態(tài)位點(diǎn)頻率的統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。突變點(diǎn)與200例健康對照者進(jìn)行序列比對及分析;對臨床伴發(fā)聽力障礙的早發(fā)DCM家系直接行線粒體全基因組測序及分析。結(jié)果:1.研究對象臨床特點(diǎn)分析:HCM患者心肌明顯增厚,多數(shù)患者伴輕度心功能不全,心電圖改變以T波改變?yōu)橹�。DCM患者全心明顯增大,左心功能明顯降低,多數(shù)患者心功能為中-重度心功能不全(根據(jù)NYHA分期),心電圖改變以QRS增寬為主。2.HCM患者線粒體基因分析結(jié)果:①在mt t RNA Gln基因上發(fā)現(xiàn)1個突變位點(diǎn)(m.4395AG),發(fā)現(xiàn)于HCM家系2;HCM家系1、其余HCM患者、DCM患者及200例健康對照者中無此位點(diǎn)改變。此位點(diǎn)堿基由A突變?yōu)镚,突變位置位于mt t RNA Gln外顯子,屬于Gln的功能保守區(qū),突變類型為點(diǎn)突變。此位點(diǎn)的突變與突尼斯一散發(fā)HCM患者的發(fā)現(xiàn)一致,該突變導(dǎo)致mt t RNA Gln結(jié)構(gòu)改變,影響蛋白質(zhì)翻譯過程,為致病性突變的可能極大。②HCM家系1未發(fā)現(xiàn)上述基因突變,也未發(fā)現(xiàn)mt cytb、mt t RNA Ile、mt t RNA Leu、mt t RNA Lys、mt t RNA Pro、mt t RNA Val、mt t RNA Ser基因的突變或多態(tài)位點(diǎn)。③其余HCM患者均未發(fā)現(xiàn)mt cytb、mt t RNA Gln、mt t RNA Ile、mt t RNA Leu、mt t RNA Lys、mt t RNA Pro、mt t RNA Val、mt t RNA Ser基因的突變或多態(tài)位點(diǎn)。3.DCM患者基因分析結(jié)果:①通過與線粒體db SNPC數(shù)據(jù)庫比對(線粒體參考基因組版“NC-012920.1”),在中國西南地區(qū)人群中發(fā)現(xiàn)了線粒體5個mt cytb基因多態(tài)位點(diǎn),分別為:m.14766CG(rs527236041)、m.14783CT(rs527236042)、m.15043GA(rs527236043)、m.15301AG(rs527236045)、m.15326 AG(rs2853508)。mt cytb基因位于線粒體基因組第14747-15887位,整個序列均為外顯子,m.15043GA、m.15301AG、m.15326 AG三個位點(diǎn)位于其功能保守區(qū),目前國內(nèi)外均無m.15043GA、m.15301AG兩個位點(diǎn)與HCM、DCM相關(guān)的報道,m.14766CG、m.15326 AG兩個位點(diǎn)與丹麥人群HCM多態(tài)位點(diǎn)一致,m.15043GA與美國人群DCM中多態(tài)位點(diǎn)一致。②分別計(jì)算mt cytb基因5個多態(tài)位點(diǎn)在DCM患者和健康對照者中的頻率,用SPSS19對二者頻率行兩獨(dú)立樣本t檢驗(yàn),檢驗(yàn)有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P0.05);并且上述多態(tài)位點(diǎn)在DCM患者中的頻率明顯高于健康對照者。由于線粒體遺傳遵循嚴(yán)格的母系遺傳和遺傳瓶頸作用,故其不適用于Hardy-Weinberg平衡及其檢驗(yàn),本實(shí)驗(yàn)結(jié)果具有患者人群代表性。③在DCM患者mt cytb基因中發(fā)現(xiàn)5個新發(fā)突變位點(diǎn),分別是m.15263CT、m.15290CA、m.15330TG、m.15338CG、m.15386TG,并且上述位點(diǎn)均位于mt cytb外顯子與它的功能保守區(qū)。200例健康對照者無上述位點(diǎn)變化。上述突變均為單個堿基的點(diǎn)突變,并造成對應(yīng)氨基酸的改變,突變位點(diǎn)測序圖無雜帶出現(xiàn)。④DCM家系患者均伴發(fā)聽力障礙的兒童患者,本研究對此家系行線粒體全基因組測序,檢測結(jié)果發(fā)現(xiàn)在mt t RNA Glu基因上存在突變位點(diǎn):m.14696AG,本研究所有HCM患者、其余DCM患者和200例健康對照者中均無此位點(diǎn)改變。此位點(diǎn)堿基由A突變?yōu)镚,測序結(jié)果分析得突變率為95.98%,突變類型為點(diǎn)突變。芬蘭人群曾報道同一突變與線粒體腦肌病相關(guān),但此突變未發(fā)現(xiàn)與原發(fā)性心肌病相關(guān)。⑤中國西南地區(qū)DCM患者未發(fā)現(xiàn)mt t RNA Gln、mt t RNA Ile、mt t RNA Leu、mt t RNA Lys、mt t RNA Pro、mt t RNA Val、mt t RNA Ser基因的突變或多態(tài)位點(diǎn)。結(jié)論:1.本研究對象臨床特點(diǎn)表明我國西南地區(qū)HCM、DCM患者以心力衰竭和心律失常為主要臨床表現(xiàn),多數(shù)患者呈散發(fā)性,部分呈家族遺傳性。2.我國西南地區(qū)漢族人群HCM與線粒體基因改變相關(guān)性分析:①在我國西南地區(qū)HCM家系患者中存在與突尼斯患者相同的線粒體基因突變位點(diǎn)(mt t RNA Gln 4395AG),已證實(shí)該突變位點(diǎn)與HCM發(fā)病具有顯著的相關(guān)性,在中國人遺傳背景下其可能是家族性HCM(Familiar Hypertrophic Cardiomyopathy,FHCM)發(fā)現(xiàn)的致病基因之一。②我國西南地區(qū)漢族人群HCM可能不存在mt cytb、mt t RNA Ile、mt t RNA Leu、mt t RNA Lys、mt t RNA Pro、mt t RNA Val、mt t RNA Ser基因的突變或多態(tài)性。3.我國西南地區(qū)漢族人群DCM與線粒體基因改變相關(guān)性分析:①首次在中國西南地區(qū)漢族人群DCM中發(fā)現(xiàn)了線粒體5個mt cytb基因多態(tài)位點(diǎn),其中m.15043GA、m.15301AG、m.15326 AG為新發(fā)的多態(tài)位點(diǎn),可以作為我國DCM和mt cytb多態(tài)位點(diǎn)分析時的一個遺傳建議;m.14766CG、m.15326 AG兩個多態(tài)位點(diǎn)屬HCM、DCM的共同多態(tài)位點(diǎn),表明線粒體基因多態(tài)性也具有遺傳異質(zhì)性的特點(diǎn)。②位于mt cytb基因的五個多態(tài)位點(diǎn)在DCM患者中的頻率明顯高于健康對照者,說明本研究發(fā)現(xiàn)的五個多態(tài)位點(diǎn)與我國西南地區(qū)DCM發(fā)病存相關(guān)性。③在mt cytb基因中發(fā)現(xiàn)了5個新發(fā)突變,測序圖提示突變均屬純合突變,位于保守區(qū)的這五個突變位點(diǎn)極大可能通過影響氧化磷酸化、呼吸鏈的形成,降低ATP生成、引起線粒體功能障礙而與DCM相關(guān)。④我國西南地區(qū)漢族人群DCM患者與mt t RNA Glu14696AG突變相關(guān),該新發(fā)突變與我國DCM患者發(fā)病相關(guān),結(jié)合芬蘭研究結(jié)果,我們推測該突變位點(diǎn)可能是DCM與線粒體腦肌病所共有;同時分析該突變來源的患者臨床特點(diǎn),推測該突變也可能是伴發(fā)聽力障礙的早發(fā)DCM患者的致病基因之一。此外,在遺傳特性明顯的家族性DCM中線粒體基因突變具有明顯的閾值效應(yīng)。⑤我國西南地區(qū)漢族人群DCM可能不存在mt t RNA Gln、mt t RNA Ile、mt t RNA Leu、mt t RNA Lys、mt t RNA Pro、mt t RNA Val、mt t RNA Ser基因的突變或多態(tài)性。
【關(guān)鍵詞】：擴(kuò)張型心肌病 肥厚型心肌病 遺傳 基因突變 單核苷酸多態(tài)性(SNP) 線粒體tRNA(mt tRNA)、線粒體cytb(mt cytb)
【學(xué)位授予單位】：四川醫(yī)科大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2015
【分類號】：R542.2
【目錄】：

• 中文摘要3-8
• 英文摘要8-15
• 前言15-17
• 材料與方法17-31
• 結(jié)果31-45
• 討論45-57
• 結(jié)論57-58
• 參考文獻(xiàn)58-64
• 英漢縮略詞對照表64-66
• 致謝66-67
• 心肌病中線粒體tRNA突變的研究進(jìn)展（綜述）67-78
• 參考文獻(xiàn)74-78
• 攻讀碩士學(xué)位期間發(fā)表論文及參與科研項(xiàng)目78-80

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1 周憲春;金東洙;;線粒體DNA變異與疾病關(guān)系相關(guān)性研究[J];現(xiàn)代醫(yī)藥衛(wèi)生;2007年15期

2 唐t，

本文編號：878867