本文關(guān)鍵詞：MiR-186靶向抑制胱硫醚-γ-裂解酶對THP-1巨噬細胞脂質(zhì)蓄積和炎癥因子分泌的影響

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【摘要】：目的:富含脂質(zhì)的巨噬細胞蓄積是動脈粥樣硬化損傷的主要特征之一,主要發(fā)生在主動脈分支處。有研究表明miR-186在心肌損傷和心肌梗死中高表達,同時在動脈粥樣硬化性疾病中起重要作用,但其背后作用機制尚不明確。值得注意的是,在本課題組之前的研究中,我們發(fā)現(xiàn)H_2S可以通過降低巨噬細胞的脂質(zhì)蓄積及促炎因子的分泌改善動脈粥樣硬化。胱硫醚-γ-裂解酶(CSE)是心血管系統(tǒng)中H_2S生成的關(guān)鍵限速酶。在本研究前期預(yù)實驗中發(fā)現(xiàn)miR-186能與CSE m RNA3’UTR端結(jié)合。本課題的研究旨在探討miR-186是否通過靶向作用于CSE繼而促進THP-1巨噬細胞的脂質(zhì)蓄積和促炎因子的分泌,并對其相關(guān)作用機制進行了初步探討。方法:首先用生物信息學(xué)軟件分析miR-186與人源CSE m RNA 3’UTR序列基本情況;接著利用雙熒光素酶報告基因分析檢測了miR-186與人源CSE m RNA 3’UTR的結(jié)合情況,同時證實了miR-186確實能與人源CSE m RNA 3’UTR結(jié)合;此外,我們利用脂質(zhì)體2000分別將scrambled miR-186、miR-186 mimic和miR-186 inhibitor轉(zhuǎn)染到THP-1泡沫源性巨噬細胞,用高效液相色譜法(HPLC)分別檢測了細胞內(nèi)膽固醇酯(CE)、游離膽固醇(FC)及總膽固醇(TC)水平;Elisa檢測細胞上清液中炎癥因子的含量變化;用Western blot和RT-PCR分別檢測細胞內(nèi)CSE和LPL蛋白及m RNA的表達;采用亞甲基藍法結(jié)合分光光度儀檢測內(nèi)源性H_2S的含量。利用CSEsi RNA干擾CSE的表達,使其表達降低。結(jié)果:通過生物信息學(xué)相關(guān)分析和雙熒光素報告酶基因檢測,發(fā)現(xiàn)miR-186恰好具有靶向調(diào)控CSE的生物信息學(xué)基礎(chǔ),能直接抑制CSE蛋白和m RNA的表達。同時,我們分別利用高效液相色譜(HPLC)法和ELISA檢測發(fā)現(xiàn)miR-186能促進THP-1巨噬細胞的脂質(zhì)蓄積和促炎因子的分泌。有研究表明,上調(diào)CSE/H_2S信號通路有顯著的抗動脈粥樣硬化作用,基于此,推測miR-186可能是通過抑制CSE促進THP-1巨噬細胞的脂質(zhì)蓄積和促炎因子的分泌。由于CSE是心血管系統(tǒng)中內(nèi)源性H_2S生成的關(guān)鍵限速酶,CSE m RNA和蛋白的表達水平的降低直接導(dǎo)致巨噬細胞內(nèi)H_2S的生成量減少。而在本研究中內(nèi)源性H_2S含量的變化,影響了THP-1巨噬細胞內(nèi)LPL m RNA和蛋白的表達,二者的變化呈負相關(guān)。而且巨噬細胞源性LPL是巨噬細胞泡沫化的一個重要因素,LPL活性及表達的增強促進了巨噬細胞內(nèi)的脂質(zhì)蓄積和炎癥因子分泌。結(jié)論:miR-186能夠抑制CSEm RNA和蛋白的表達,降低內(nèi)源性H_2S的含量,使巨噬細胞內(nèi)LPL表達增強,促進巨噬細胞的脂質(zhì)蓄積和促炎因子的分泌。
【關(guān)鍵詞】：MiR-186 胱硫醚-γ-裂解酶 THP-1巨噬細胞 脂質(zhì)蓄積
【學(xué)位授予單位】：南華大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2016
【分類號】：R543.5
【目錄】：

• 摘要4-6
• ABSTRACT6-13
• 第1章 緒論13-15
• 第2章 實驗材料15-19
• 2.1 預(yù)測軟件15
• 2.2 主要實驗試劑15-16
• 2.3 試劑配制16-17
• 2.4 主要實驗器材17-19
• 第3章 實驗方法19-25
• 3.1 細胞培養(yǎng)19
• 3.2 生物信息學(xué)分析19
• 3.3 miR-186mimic/inhibitor的轉(zhuǎn)染和熒光素酶活性檢測19-20
• 3.4 蛋白質(zhì)印跡20-21
• 3.5 實時定量PCR21-22
• 3.6 高效液相色譜22
• 3.7 H_2S含量的測定22-23
• 3.8 ELISA測定炎癥因子23-24
• 3.9 CSEsiRNA的轉(zhuǎn)染24
• 3.10 LPL活性測定24
• 3.11 統(tǒng)計分析24-25
• 第4章 實驗結(jié)果25-37
• 4.1 生物信息學(xué)預(yù)測結(jié)果25-26
• 4.2 miR-186與THP-1細胞CSE的靶向結(jié)合作用26-27
• 4.3 miR-186對THP-1巨噬細胞中CSE表達及內(nèi)源性H_2S含量的影響27-30
• 4.4 miR-186對經(jīng)oxLDL處理的THP-1巨噬細胞內(nèi)脂質(zhì)的影響30-31
• 4.5 miR-186對經(jīng)oxLDL處理的THP-1 巨噬細胞促炎因子分泌的影響31-32
• 4.6 CSE在miR-186促進THP-1 巨噬細胞脂質(zhì)蓄積及促炎因子分泌中的作用32-37
• 第5章 討論37-41
• 第6章 結(jié)論41-43
• 參考文獻43-49
• 文獻綜述 PPARs在長鏈脂肪酸調(diào)控能量代謝中的作用49-61
• 參考文獻57-61
• 攻讀學(xué)位期間所獲科研成果61-63
• 致謝63

【參考文獻】

中國期刊全文數(shù)據(jù)庫 前1條

1 張揚;朱昆;;貝特類調(diào)血脂前藥與類似物的研究進展[J];吉林化工學(xué)院學(xué)報;2014年03期

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本文編號：874864