本文關鍵詞：MiR-186靶向抑制胱硫醚-γ-裂解酶對THP-1巨噬細胞脂質蓄積和炎癥因子分泌的影響

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【摘要】：目的:富含脂質的巨噬細胞蓄積是動脈粥樣硬化損傷的主要特征之一,主要發(fā)生在主動脈分支處。有研究表明miR-186在心肌損傷和心肌梗死中高表達,同時在動脈粥樣硬化性疾病中起重要作用,但其背后作用機制尚不明確。值得注意的是,在本課題組之前的研究中,我們發(fā)現(xiàn)H_2S可以通過降低巨噬細胞的脂質蓄積及促炎因子的分泌改善動脈粥樣硬化。胱硫醚-γ-裂解酶(CSE)是心血管系統(tǒng)中H_2S生成的關鍵限速酶。在本研究前期預實驗中發(fā)現(xiàn)miR-186能與CSE m RNA3’UTR端結合。本課題的研究旨在探討miR-186是否通過靶向作用于CSE繼而促進THP-1巨噬細胞的脂質蓄積和促炎因子的分泌,并對其相關作用機制進行了初步探討。方法:首先用生物信息學軟件分析miR-186與人源CSE m RNA 3’UTR序列基本情況;接著利用雙熒光素酶報告基因分析檢測了miR-186與人源CSE m RNA 3’UTR的結合情況,同時證實了miR-186確實能與人源CSE m RNA 3’UTR結合;此外,我們利用脂質體2000分別將scrambled miR-186、miR-186 mimic和miR-186 inhibitor轉染到THP-1泡沫源性巨噬細胞,用高效液相色譜法(HPLC)分別檢測了細胞內膽固醇酯(CE)、游離膽固醇(FC)及總膽固醇(TC)水平;Elisa檢測細胞上清液中炎癥因子的含量變化;用Western blot和RT-PCR分別檢測細胞內CSE和LPL蛋白及m RNA的表達;采用亞甲基藍法結合分光光度儀檢測內源性H_2S的含量。利用CSEsi RNA干擾CSE的表達,使其表達降低。結果:通過生物信息學相關分析和雙熒光素報告酶基因檢測,發(fā)現(xiàn)miR-186恰好具有靶向調控CSE的生物信息學基礎,能直接抑制CSE蛋白和m RNA的表達。同時,我們分別利用高效液相色譜(HPLC)法和ELISA檢測發(fā)現(xiàn)miR-186能促進THP-1巨噬細胞的脂質蓄積和促炎因子的分泌。有研究表明,上調CSE/H_2S信號通路有顯著的抗動脈粥樣硬化作用,基于此,推測miR-186可能是通過抑制CSE促進THP-1巨噬細胞的脂質蓄積和促炎因子的分泌。由于CSE是心血管系統(tǒng)中內源性H_2S生成的關鍵限速酶,CSE m RNA和蛋白的表達水平的降低直接導致巨噬細胞內H_2S的生成量減少。而在本研究中內源性H_2S含量的變化,影響了THP-1巨噬細胞內LPL m RNA和蛋白的表達,二者的變化呈負相關。而且巨噬細胞源性LPL是巨噬細胞泡沫化的一個重要因素,LPL活性及表達的增強促進了巨噬細胞內的脂質蓄積和炎癥因子分泌。結論:miR-186能夠抑制CSEm RNA和蛋白的表達,降低內源性H_2S的含量,使巨噬細胞內LPL表達增強,促進巨噬細胞的脂質蓄積和促炎因子的分泌。
【關鍵詞】：MiR-186 胱硫醚-γ-裂解酶 THP-1巨噬細胞 脂質蓄積
【學位授予單位】：南華大學
【學位級別】：碩士
【學位授予年份】：2016
【分類號】：R543.5
【目錄】：

• 摘要4-6
• ABSTRACT6-13
• 第1章 緒論13-15
• 第2章 實驗材料15-19
• 2.1 預測軟件15
• 2.2 主要實驗試劑15-16
• 2.3 試劑配制16-17
• 2.4 主要實驗器材17-19
• 第3章 實驗方法19-25
• 3.1 細胞培養(yǎng)19
• 3.2 生物信息學分析19
• 3.3 miR-186mimic/inhibitor的轉染和熒光素酶活性檢測19-20
• 3.4 蛋白質印跡20-21
• 3.5 實時定量PCR21-22
• 3.6 高效液相色譜22
• 3.7 H_2S含量的測定22-23
• 3.8 ELISA測定炎癥因子23-24
• 3.9 CSEsiRNA的轉染24
• 3.10 LPL活性測定24
• 3.11 統(tǒng)計分析24-25
• 第4章 實驗結果25-37
• 4.1 生物信息學預測結果25-26
• 4.2 miR-186與THP-1細胞CSE的靶向結合作用26-27
• 4.3 miR-186對THP-1巨噬細胞中CSE表達及內源性H_2S含量的影響27-30
• 4.4 miR-186對經(jīng)oxLDL處理的THP-1巨噬細胞內脂質的影響30-31
• 4.5 miR-186對經(jīng)oxLDL處理的THP-1 巨噬細胞促炎因子分泌的影響31-32
• 4.6 CSE在miR-186促進THP-1 巨噬細胞脂質蓄積及促炎因子分泌中的作用32-37
• 第5章 討論37-41
• 第6章 結論41-43
• 參考文獻43-49
• 文獻綜述 PPARs在長鏈脂肪酸調控能量代謝中的作用49-61
• 參考文獻57-61
• 攻讀學位期間所獲科研成果61-63
• 致謝63

【參考文獻】

中國期刊全文數(shù)據(jù)庫 前1條

1 張揚;朱昆;;貝特類調血脂前藥與類似物的研究進展[J];吉林化工學院學報;2014年03期

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本文編號：874864