本文關鍵詞：Fgl2過表達下調(diào)PD-1的表達對自身免疫性心肌炎大鼠心功能的影響及分子機制研究

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【摘要】：目的:本實驗目的在于建立大鼠自身免疫性心肌炎模型,通過對免疫負性調(diào)控信號分子PD-1在自身免疫性心肌炎大鼠心肌中的表達情況的檢測,分析其在自身免疫性心肌炎病程發(fā)展中的意義,并以慢病毒介導Fgl2基因過表達進行干預,探討Fgl2作為治療自身免疫性心肌炎心肌免疫性損傷的干預靶點的可行性及其相關機制。方法:選擇購買SPF級雄性6-7周齡Lewis大鼠32只,隨機選取8只為正常對照組(NC組),余24只為實驗組:以純化的豬心肌肌球蛋白(PCM)皮下注射法建立大鼠實驗性自身免疫性心肌炎模型。實驗組隨機分為3組,每組8只,即實驗性自身免疫性心肌炎組(EAM組)、Fgl2慢病毒過表達自身免疫性心肌炎組(EAM-Fgl2組)、空載體組(EAM-GFP組)。EAM-Fgl2組與EAM-GFP組大鼠于造模第1天,分別經(jīng)大鼠尾靜脈注射包裝好的Fgl2過表達慢病毒載體和等量的GFP慢病毒載體(5x107TU/只)。第40天,對各組大鼠行超聲心動圖檢測,分別測定LVEDd、LVEDs、LVEF、LVFS等指標。完成超聲檢測后,摘除眼球取血提取血清,用于ELISA檢測IL-17、IL-6、INF-γ炎性因子及BNP水平。處死大鼠后摘除心臟,一部分用于HE染色觀察心肌炎性程度,另一部分用于提取蛋白,Western blot檢測Fgl2、PD-1、Foxp3、RORγt蛋白表達,提取心肌組織mRNA,RT-PCR檢測Fgl2、PD-1、Foxp3、RORγt的mRNA的表達情況。結果:(1)實驗組大鼠出現(xiàn)明顯的心功能不全的表現(xiàn):免疫40天后,實驗組大鼠出現(xiàn)弓背,呼吸頻率增快,進食量、進水量、活動量均明顯減少,體重減輕。(2)心功能改變情況:超聲心動圖檢測示,實驗組大鼠心臟明顯擴大,HR、LVEF、LVFS較NC組降低,其中EAM-Fgl2組降低更明顯(P0.05),提示Fgl2過表達加重心功能惡化程度。(3)心肌病理切片HE染色觀察心肌損傷程度:正常組心肌細胞形態(tài)結構未見明顯改變;實驗組可見心肌細胞肥大,肌纖維排列紊亂,間質(zhì)水腫;EAM-Fgl2組表現(xiàn)為心肌細胞變性、壞死,間質(zhì)纖維化,可見嗜酸性粒細胞、淋巴細胞浸潤。Rezkalla法計算心肌炎性積分,EAM-Fgl2組較EAM組炎性積分增高(P0.05)。(4)血清ELISA檢測相關炎癥因子及BNP水平:與NC組比較,實驗組大鼠血清中BNP、IL17、IL-6的表達水平增高(P0.05),其中EAM-Fgl2組與EAM組相比,BNP、IL-6及IL17明顯升高(P0.05),EAM組與EAM-GFP組無差異。(5)RT-PCR及Western blot檢測結果示:實驗組Fgl2、RORγt、Foxp3的mRNA及蛋白表達量均較NC組增高(P0.05),PD-1的mRNA及蛋白的表達量較NC組降低,EAM-Fgl2組Fgl2過表達使Fgl2的mRNA及蛋白表達量明顯增高,PD-1的mRNA蛋白表達量則較EAM組進一步降低(P0.05)。結論:(1)Lewis大鼠通過注射豬心肌肌球蛋白可成功誘導實驗性自身免疫性心肌炎大鼠模型。(2)免疫性心肌炎大鼠心肌中PD-1的mRNA及蛋白表達降低。(3)慢病毒介導的Fgl2過表達可下調(diào)PD-1的表達,上調(diào)免疫性心肌炎大鼠血清中炎癥因子的表達,加重心肌炎性程度,使心功能惡化更明顯。(4)Fgl2及PD-1可能共同參與了實驗性自身免疫性心肌炎大鼠心肌炎的免疫炎性反應過程。
【關鍵詞】：免疫性心肌炎 凝血酶原酶(Fgl2) 程序性死亡因子1(PD-1) 心功能 白介素17(IL-17)
【學位授予單位】：南昌大學
【學位級別】：碩士
【學位授予年份】：2016
【分類號】：R542.21
【目錄】：

• 摘要3-5
• ABSTRACT5-9
• 中英文縮寫詞表9-10
• 第1章 引言10-12
• 第2章 材料與方法12-22
• 2.1 實驗材料12-15
• 2.1.1 實驗動物12
• 2.1.2 主要試劑12-13
• 2.1.3 主要儀器13-14
• 2.1.4 主要試劑配置14-15
• 2.2 實驗方法15-21
• 2.2.1 建立動物模型和分組15
• 2.2.2 觀察項目及檢測方法15-21
• 2.3 統(tǒng)計學分析21-22
• 第3章 實驗結果22-28
• 3.1 一般情況22
• 3.2 心臟彩超心功能改變22-23
• 3.3 心肌組織病理學改變23-25
• 3.4 酶聯(lián)免疫法檢測大鼠血清炎癥因子水平25
• 3.5 熒光定量PCR檢測m RNA表達25-27
• 3.6 WESTEN BLOT檢測蛋白表達27-28
• 第4章 討論28-33
• 4.1 Fgl2過表達自身免疫性心肌炎大鼠模型的建立28-29
• 4.2 Fgl2過表達使自身免疫性心肌炎大鼠心功能降低29
• 4.3 自身免疫性心肌炎大鼠心肌中PD-1 的表達下調(diào)29-30
• 4.4 Fgl2、PD-1 在自身免疫性心肌炎中免疫調(diào)節(jié)機制的探討30-33
• 第5章 結論33-34
• 致謝34-35
• 參考文獻35-38
• 綜述38-43
• 參考文獻42-43

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本文編號：857191