發(fā)布時(shí)間：2017-09-13 13:22

  本文關(guān)鍵詞：骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞聯(lián)合內(nèi)皮祖細(xì)胞構(gòu)建血管網(wǎng)絡(luò)化組織工程化心肌

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【摘要】：目的:分離、培養(yǎng)大鼠骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞(Bone marrow mesenchymal stem cells,BMSCs)和內(nèi)皮祖細(xì)胞(Endothelial progenitor cells,EPCs),應(yīng)用BMSCs聯(lián)合不同比例EPCs與脫細(xì)胞牛心包體外構(gòu)建具有血管網(wǎng)絡(luò)化的工程化心肌樣組織,并將聯(lián)合構(gòu)建的各組工程化心肌樣組織植入裸鼠體內(nèi),檢測微血管網(wǎng)絡(luò)的形成。論證聯(lián)合應(yīng)用大鼠BMSCs和EPCs體外構(gòu)建具有血管化網(wǎng)絡(luò)的工程化心肌樣組織的可行性,及植入體內(nèi)后生成的新生血管網(wǎng)絡(luò)功能的有效性,并探討B(tài)MSCs/EPCs聯(lián)合應(yīng)用的促進(jìn)血管網(wǎng)絡(luò)化形成的最佳比例。方法:第一部分:分離、培養(yǎng)BMSCs,經(jīng)流式對其進(jìn)行鑒定。應(yīng)用Ang II將BMSCs向心肌細(xì)胞定向誘導(dǎo)分化,對照組未添加誘導(dǎo)劑,采用MTT法檢測各組細(xì)胞增殖曲線,并通過與對照組的對比計(jì)算不同濃度誘導(dǎo)組的細(xì)胞增殖抑制率。采用免疫熒光法檢測各誘導(dǎo)組及對照組第1、4周心肌特異蛋白c Tn T、β-MHC的表達(dá),并計(jì)算細(xì)胞轉(zhuǎn)化率。RT-PCR檢測不同濃度Ang II誘導(dǎo)組細(xì)胞培養(yǎng)4周時(shí)表達(dá)心肌早期轉(zhuǎn)錄因子GATA-4、Nkx2-5的情況。第二部分:分離、培養(yǎng)EPCs,通過免疫熒光法檢測細(xì)胞表型v WF、FLK-1、CD34、CD133的表達(dá),鑒定所獲細(xì)胞為EPCs。用去污劑-酶消化法對新鮮牛心包進(jìn)行脫細(xì)胞處理,并通過HE染色、SEM對其脫細(xì)胞前后的形態(tài)學(xué)及表面情況變化進(jìn)行觀察,計(jì)算脫細(xì)胞效率。將Ang II誘導(dǎo)培養(yǎng)4周的BMSCs,聯(lián)合第1代EPCs與脫細(xì)胞牛心包生物支架材料進(jìn)行體外復(fù)合培養(yǎng),HE染色、SEM觀察細(xì)胞在脫細(xì)胞牛心包上的形態(tài)及黏附生長情況。然后將體外構(gòu)建的細(xì)胞/支架材料移植于裸鼠背部皮袋內(nèi),術(shù)后1、4周手術(shù)尋回植體,行HE染色、免疫組織化學(xué)染色及RT-PCR對微血管及心肌特異蛋白、基因進(jìn)行檢測,并觀察構(gòu)建的工程化心肌內(nèi)部血管網(wǎng)絡(luò)組織形成情況。結(jié)果:第一部分:原代培養(yǎng)的BMSCs 5~6天細(xì)胞開始成簇生長,形態(tài)為長梭形及多角形,呈旋渦狀排列。12~14天細(xì)胞長成單層。流式檢測細(xì)胞CD29表達(dá)陽性,CD45表達(dá)陰性。Ang II各誘導(dǎo)組間的細(xì)胞增殖曲線相似,0.05μmol/L組細(xì)胞增殖抑制率于第5天出現(xiàn)負(fù)值,與其他組有顯著性意義(P0.05)。第5,7天0.1μmol/L組細(xì)胞增殖抑制率明顯低于0.2,0.5μmol/L組(P0.05)。各誘導(dǎo)組的BMSCs均可表達(dá)c Tn T、β-MHC。誘導(dǎo)1周,0.5μmol/L組c Tn T、β-MHC蛋白陽性表達(dá)率明顯高于0.05μmol/L組(P0.05)。誘導(dǎo)4周,0.1μmol/L組與0.2μmol/L組兩種蛋白陽性表達(dá)率均相似(P0.05)。對照組于1,4周表達(dá)均為陰性。誘導(dǎo)4周,經(jīng)RT-PCR檢測各誘導(dǎo)組BMSCs均可表達(dá)轉(zhuǎn)錄因子GATA-4、Nkx2.5,對照組表達(dá)陰性。第二部分:原代EPCs培養(yǎng)至7天左右逐漸出現(xiàn)貼壁細(xì)胞,第18天細(xì)胞融合可達(dá)80%,傳代后子代細(xì)胞單層生長,鋪路石樣排列,增殖力旺盛。第1代細(xì)胞經(jīng)免疫熒光化學(xué)染色檢測v WF、FLK-1及CD34、CD133均為陽性。新鮮的牛心包經(jīng)去污劑-酶聯(lián)合四步法脫細(xì)胞處理和交聯(lián)劑京尼平溶液固定后,HE染色觀察脫細(xì)胞處理的效率接近100%。SEM檢測其超微結(jié)構(gòu):脫細(xì)胞處理后的牛心包表明無細(xì)胞殘留且表面排列雜亂,放大后可見有2μm小孔。新鮮牛心包表明覆蓋有排列致密的細(xì)胞層。三組細(xì)胞在處理后牛心包支架材料上培養(yǎng),隨著培養(yǎng)時(shí)間的延長,細(xì)胞數(shù)量逐步增加,經(jīng)SEM觀察發(fā)現(xiàn)三組細(xì)胞在材料上黏附良好。將細(xì)胞/支架材料植入裸鼠后,傷口無紅腫、滲液,于第一周時(shí)I期愈合。1周各植入組植入物取回后發(fā)現(xiàn)大小無明顯變化,呈深藍(lán)色,質(zhì)地略硬,未見明顯包膜。HE染色結(jié)果示:術(shù)后4周,各組植入物取回后顏色深藍(lán)色,各組植入物表面有明顯血管長入,且支架材料的周邊潤滑圓頓。BMSCs/EPCs組支架材料血管長入較BMSCs組及EPCs組明顯,且周圍血管豐富;BMSCs/EPCs的比例對血管的生成有一定影響,最佳比例為80:20。結(jié)論:(1)體外可以經(jīng)大鼠骨髓分離、培養(yǎng)獲得BMSCs和EPCs。(2)經(jīng)AngⅡ誘導(dǎo)的BMSCs表達(dá)心肌特異蛋白c Tn T、β-MHC及轉(zhuǎn)錄因子GATA-4、Nkx2.5,且誘導(dǎo)分化適宜濃度為0.1μmol/L。(3)去污劑-酶聯(lián)合四步法脫細(xì)胞處理牛心包,去細(xì)胞率可達(dá)100%,BMSCs/EPCs可與其良好粘附,可以成為構(gòu)建工程化心肌的良好支架。(4)BMSCs/EPCs是構(gòu)建心肌/血管組織工程的種子細(xì)胞,可在大鼠體內(nèi)形成組織工程化心肌,并且可以促進(jìn)工程化心肌新生血管網(wǎng)絡(luò)的形成。證實(shí)了構(gòu)建的混合細(xì)胞/脫細(xì)胞牛心包是一種良好的工程化心肌組織材料。
【關(guān)鍵詞】：心肌組織工程 骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞 內(nèi)皮祖細(xì)胞 脫細(xì)胞牛心包 血管化
【學(xué)位授予單位】：山西醫(yī)科大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2015
【分類號(hào)】：R318.08;R54
【目錄】：

• 中文摘要6-9
• 英文摘要9-13
• 常用縮寫詞中英文對照表13-14
• 前言14-18
• 第一部分 不同濃度血管緊張素Ⅱ誘導(dǎo)骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞向心肌細(xì)胞的定向分化的影響18-35
• 1 材料與方法18-25
• 1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物18
• 1.2 主要試劑和儀器18-19
• 1.3 實(shí)驗(yàn)器材19
• 1.4 BMSCs 體外分離及培養(yǎng)19-20
• 1.5 BMSCS特征性表型鑒定20
• 1.6 免疫熒光檢測骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞誘導(dǎo)后的特異蛋白表達(dá)20-21
• 1.7 檢測大鼠骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞體外誘導(dǎo)后抑制率21-22
• 1.8 PCR鑒定相關(guān)蛋白MRNA表達(dá)22-25
• 2 結(jié)果25-31
• 2.1 細(xì)胞形態(tài)學(xué)變化25-27
• 2.2 BMSCS特征性表型鑒定27
• 2.3 免疫熒光檢測骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞誘導(dǎo)后的特異蛋白的表達(dá)27-29
• 2.4 大鼠骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞誘導(dǎo)后增殖能力及抑制率29-30
• 2.5 PCR鑒定相關(guān)蛋白MRNA表達(dá)30-31
• 3 討論31-34
• 4 結(jié)論34-35
• 第二部分：基于BMSCS/EPCS體外構(gòu)建具有血管化網(wǎng)絡(luò)的組織工程化心肌35-61
• 1 材料與方法35-43
• 1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物35
• 1.2 主要試劑和儀器35-36
• 1.3 EPCS體外分離及培養(yǎng)36-37
• 1.4 大鼠EPCS表面標(biāo)記的檢測37
• 1.5 新型脫細(xì)胞牛心包生物支架材料的制備37-38
• 1.6 對處理后的脫細(xì)胞牛心包進(jìn)行消毒38
• 1.7 對脫細(xì)胞牛心包組織學(xué)觀察38-39
• 1.8 大鼠BMSCS/EPCS聯(lián)合培養(yǎng)復(fù)合脫細(xì)胞牛心包支架材料體外構(gòu)建組織工程化心肌的實(shí)驗(yàn)研究39
• 1.9 觀察各組細(xì)胞在支架上的生長情況39
• 1.10 大鼠BMSCS/EPCS聯(lián)合培養(yǎng)復(fù)合京尼平交聯(lián)的脫細(xì)胞牛心包支架材料異位構(gòu)建血管網(wǎng)絡(luò)化組織工程化心肌的實(shí)驗(yàn)研究39-41
• 1.11 對構(gòu)建最佳比例血管網(wǎng)絡(luò)化組織工程化心肌的研究檢測41-43
• 2 結(jié)果43-56
• 2.1 形態(tài)學(xué)變化43-44
• 2.2 免疫熒光染色鑒定EPCS相關(guān)蛋白的表達(dá)44-45
• 2.3 牛心包脫細(xì)胞的處理過程及形態(tài)學(xué)變化45-48
• 2.4 大鼠BMSCS/EPCS聯(lián)合培養(yǎng)復(fù)合脫細(xì)胞牛心包支架材料體外構(gòu)建組織工程化心肌的實(shí)驗(yàn)觀察48-50
• 2.5 大鼠BMSCS/EPCS聯(lián)合培養(yǎng)復(fù)合京尼平交聯(lián)的脫細(xì)胞牛心包支架材料異位構(gòu)建血管網(wǎng)絡(luò)化組織工程化心肌的實(shí)驗(yàn)研究50-54
• 2.6 對構(gòu)建最佳比例血管網(wǎng)絡(luò)化組織工程化心肌的研究檢測54-56
• 3 討論56-60
• 4 結(jié)論60-61
• 參考文獻(xiàn)61-67
• 綜述67-78
• 參考文獻(xiàn)75-78
• 致謝78-79
• 在學(xué)期間承擔(dān)/參與的科研課題與研究成果79-80
• 個(gè)人簡歷80

【參考文獻(xiàn)】

中國期刊全文數(shù)據(jù)庫 前10條

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