發(fā)布時(shí)間：2017-09-11 07:27

  本文關(guān)鍵詞：在體外模擬冠狀動(dòng)脈痙攣微環(huán)境下下調(diào)Caveolin-1對(duì)人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞分泌NO和ET-1的影響

  更多相關(guān)文章： Caveolin-1 一氧化氮 內(nèi)皮素-1 脂多糖 乙酰膽堿 冠狀動(dòng)脈痙攣

【摘要】：目的通過體外細(xì)胞實(shí)驗(yàn)研究在致內(nèi)皮損傷脂多糖(lipopolysaccharide,LPS)及致冠狀動(dòng)脈痙攣物質(zhì)乙酰膽堿(acetylcholine,Ach)微環(huán)境中下調(diào)Caveolin-1(Cav-1)的表達(dá)對(duì)人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞(primary human umbilical vein endothelial cell,HUVECs)分泌一氧化氮(nitric oxide,NO)及內(nèi)皮素-1(endothelin-1,ET-1)的影響,初步探索通過下調(diào)Cav-1的表達(dá)能否促進(jìn)NO的產(chǎn)生,降低ET-1的分泌,從而在一定程度上緩解或者抑制冠狀動(dòng)脈痙攣(CAS)的發(fā)生。方法人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞(HUVECs)的培養(yǎng)及鑒定。將原代人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞接種于ECM完全培養(yǎng)基(5%胎牛血清,1%內(nèi)皮細(xì)胞生長因子,1%的青霉素/鏈霉素抗生素),37°C含5%CO2的溫箱培養(yǎng)。倒置顯微鏡觀察內(nèi)皮細(xì)胞生長情況,免疫熒光法鑒定內(nèi)皮細(xì)胞的Ⅷ因子相關(guān)抗原。選擇3對(duì)小干擾RNA(si RNA)序列下調(diào)Cav-1的表達(dá),Western-blot印跡法檢測(cè)Cav-1蛋白表達(dá)水平的變化。脂多糖(LPS)構(gòu)建內(nèi)皮功能損傷模型:分別用不同濃度(0、10、25、50、75、100μg/m L)LPS體外誘導(dǎo)陰性轉(zhuǎn)染組(HUVECs/si-NC)和Cav-1表達(dá)下調(diào)組(HUVECs/si Cav-1),CCK8(cell counting kit-8)法觀察LPS對(duì)HUVECs活性的影響。WST-1(一種高度水溶性四唑鹽)法測(cè)定檢測(cè)細(xì)胞上清液中超氧化物歧化酶(superoxide dimutase,SOD)的抑制率。采用Ach刺激內(nèi)皮細(xì)胞構(gòu)建冠脈痙攣微環(huán)境模型:根據(jù)前期實(shí)驗(yàn)結(jié)果,選用75μg/m L的LPS干預(yù)內(nèi)皮細(xì)胞24h構(gòu)建內(nèi)皮損傷模型,以此細(xì)胞模型為基礎(chǔ)用10μmol/L乙酰膽堿(Ach)模擬冠脈痙攣微環(huán)境:以Ca2+熒光指示劑Fluo4-AM為探針,倒置熒光顯微鏡檢測(cè)細(xì)胞內(nèi)鈣離子水平([Ca2+]i)的變化評(píng)價(jià)模型的構(gòu)建。實(shí)驗(yàn)分組:取3-5代的HUVECs進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。將等量細(xì)胞數(shù)接種生長24h后分別加入0、75μg/m L LPS作用24h,更換為含有Ach的孵育液培養(yǎng),分別取上清檢測(cè)NO和ET-1的含量。測(cè)定NO和ET-1含量,實(shí)驗(yàn)分為8組:(1)HUVECs/si-NC;(2)HUVECs/si-NC+LPS;(3)HUVECs/si-NC+Ach;(4)HUVECs/si-NC+LPS+Ach;(5)HUVECs/si Cav-1;(6)HUVECs/si Cav-1+LPS;(7)HUVECs/si Cav-1+Ach;(8)HUVECs/si Cav-1+LPS+Ach.硝酸還原酶法測(cè)定上述各組細(xì)胞上清NO含量,酶聯(lián)免疫吸附法(ELISA)測(cè)定上述各組細(xì)胞上清ET-1含量。結(jié)果倒置顯微鏡和免疫熒光結(jié)果顯示,在倒置顯微鏡下觀察單個(gè)細(xì)胞呈典型的鋪路石樣生長,成團(tuán)的細(xì)胞呈魚貫樣或漩渦狀生長。倒置熒光顯微鏡下觀察,DAPI熒光染料著色細(xì)胞核呈藍(lán)色,胞漿內(nèi)有綠色熒光顆粒,Ⅷ因子表達(dá)陽性。Western blot印跡結(jié)果顯示,si RNA干擾后Cav-1蛋白表達(dá)水平均下降,尤以si Cav-1(2)下調(diào)最明顯。LPS作用24小時(shí)誘導(dǎo)內(nèi)皮損傷呈劑量依賴性,LPS濃度在75μg/m L時(shí)HUVECs/si-NC和HUVECs/si Cav-1分別與空白對(duì)照組相比細(xì)胞存活率明顯降低(P0.05),并且在75μg/m L時(shí)HUVECs/si-NC和HUVECs/si Cav-1分別與空白對(duì)照組相比SOD抑制率下降,有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P0.05),間接反映內(nèi)皮細(xì)胞損傷模型構(gòu)建成功。Ach刺激未受損傷的HUVECs/si-NC,[Ca2+]i明顯增加而Ach刺激LPS損傷的HUVECs/si-NC,[Ca2+]i水平變化很小甚至不明顯,說明冠脈痙攣微環(huán)境模擬成功。在Ach刺激下,受損傷的HUVECs/si Cav-1產(chǎn)生的NO較受損傷的HUVECs/si-NC多(P0.05),二者有明顯的統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。Ach刺激受損傷的HUVECs/si Cav-1和受損傷的HUVECs/si-NC,二者ET-1的含量無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。結(jié)論在LPS和Ach共同模擬的冠脈痙攣微環(huán)境下,下調(diào)Cav-1的表達(dá)能夠促進(jìn)HUVECs對(duì)NO的分泌,但對(duì)ET-1的分泌無影響,本研究為冠脈痙攣的預(yù)防和治療提供了新靶點(diǎn)。
【關(guān)鍵詞】：Caveolin-1 一氧化氮 內(nèi)皮素-1 脂多糖 乙酰膽堿 冠狀動(dòng)脈痙攣
【學(xué)位授予單位】：首都醫(yī)科大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2016
【分類號(hào)】：R543.3
【目錄】：

• 中文摘要4-7
• 英文摘要7-9
• 前言9-12
• 材料和方法12-24
• 一．實(shí)驗(yàn)材料12-16
• 二．實(shí)驗(yàn)方法16-24
• 實(shí)驗(yàn)結(jié)果24-32
• 1. 原代人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞的形態(tài)學(xué)和免疫熒光學(xué)鑒定24
• 2. si Cav-1(2)明顯降低 Cav-1 的蛋白表達(dá)水平24-25
• 3. 75μg/ml 脂多糖能顯著降低 HUVECs/si-NC 和 HUVECs/si Cav-1 細(xì)胞活性25-26
• 4. 75μg/m L 脂多糖明顯降低 HUVECs/si-NC 和 HUVECs/si Cav-1 細(xì)胞 SOD 抑制率26-27
• 5. 受損傷和未受損傷的HUVECs/si-NC細(xì)胞內(nèi)鈣離子([Ca2+]i)對(duì)Ach的反應(yīng)27-29
• 6. Ach 刺激損傷細(xì)胞時(shí)，Cav-1 下調(diào)能促進(jìn)NO的釋放29-30
• 7. Ach 刺激損傷內(nèi)皮細(xì)胞時(shí)，，ET-1 的含量無明顯改變30-32
• 討論32-34
• 結(jié)論34-35
• 參考文獻(xiàn)35-40
• 綜述40-49
• 參考文獻(xiàn)44-49
• 碩士期間文章發(fā)表情況49-50
• 致謝50-52
• 個(gè)人簡歷52-53

【相似文獻(xiàn)】

中國期刊全文數(shù)據(jù)庫 前10條

1 徐紅霞,劉應(yīng)才;冠狀動(dòng)脈痙攣致意識(shí)喪失1例報(bào)告[J];新醫(yī)學(xué);2000年04期

2 陳丹萌;于秋;張勝鵬;劉菊芳;陳佳家;;急性冠狀動(dòng)脈痙攣持續(xù)9小時(shí)1例[J];醫(yī)學(xué)理論與實(shí)踐;2008年01期

3 于紅;;冠狀動(dòng)脈痙攣的基礎(chǔ)與臨床研究進(jìn)展[J];中國實(shí)用神經(jīng)疾病雜志;2010年05期

4 王慧生;;冠狀動(dòng)脈痙攣的臨床特征[J];心血管病譯文;1985年04期

5 Hirofumi Yasue;相洪琴;;冠狀動(dòng)脈痙攣發(fā)病機(jī)制臨床特征及其治療[J];國外醫(yī)學(xué)情報(bào);1993年20期

6 戎順?biāo)?朱志遠(yuǎn),楊麗萍,畢瑛,徐任璇,陳軍;冠狀動(dòng)脈痙攣致反復(fù)暈厥二例[J];上海醫(yī)學(xué);2000年05期

7 周云;冠狀動(dòng)脈痙攣實(shí)驗(yàn)?zāi)Ｐ偷母倪M(jìn)[J];咸寧醫(yī)學(xué)院學(xué)報(bào);2000年03期

8 張慶,曾智,黃德嘉,張立;3例右冠狀動(dòng)脈痙攣致Ⅲ度房室傳導(dǎo)阻滯臨床分析[J];華西醫(yī)學(xué);2001年02期

9 鮑建英;冠狀動(dòng)脈痙攣[J];齊魯醫(yī)學(xué)雜志;2001年04期

10 劉金祥;心理因素與冠狀動(dòng)脈痙攣[J];醫(yī)學(xué)綜述;2002年10期

中國重要會(huì)議論文全文數(shù)據(jù)庫 前9條

1 曾定尹;;冠狀動(dòng)脈痙攣與缺血性心臟病[A];中華醫(yī)學(xué)會(huì)第十三次全國心血管病學(xué)術(shù)會(huì)議專題報(bào)告專輯[C];2011年

2 曾定尹;張海山;;冠狀動(dòng)脈痙攣與冠狀動(dòng)脈疾病[A];中華醫(yī)學(xué)會(huì)心血管病學(xué)分會(huì)第十次全國心血管病學(xué)術(shù)會(huì)議匯編[C];2008年

3 曾定尹;高淵;;冠狀動(dòng)脈痙攣研究現(xiàn)狀[A];中華醫(yī)學(xué)會(huì)第十一次全國心血管病學(xué)術(shù)會(huì)議專題報(bào)告匯編[C];2009年

4 牟春平;王文凱;;冠狀動(dòng)脈痙攣與急性冠狀動(dòng)狀動(dòng)脈綜合征[A];第十三次全國心血管病學(xué)術(shù)會(huì)議論文集[C];2011年

5 黃從春;江一清;劉朝中;王文清;;實(shí)驗(yàn)性冠狀動(dòng)脈痙攣對(duì)心腦血管的影響[A];第四屆全國心功能學(xué)術(shù)研討會(huì)論文摘要集[C];1994年

6 喻學(xué)剛;于娜;馬茂儒;;冠狀動(dòng)脈痙攣?[A];2011·中國醫(yī)師協(xié)會(huì)中西醫(yī)結(jié)合醫(yī)師大會(huì)論文集[C];2011年

7 關(guān)啟剛;曾定尹;;通心絡(luò)抑制IL-1β介導(dǎo)的小型家豬冠狀動(dòng)脈痙攣的作用及機(jī)制[A];中華醫(yī)學(xué)會(huì)心血管病學(xué)分會(huì)第八次全國心血管病學(xué)術(shù)會(huì)議匯編[C];2006年

8 王廣;于婕;洪天配;;甲亢誘發(fā)冠狀動(dòng)脈痙攣一例報(bào)告[A];中華醫(yī)學(xué)會(huì)第十次全國內(nèi)分泌學(xué)學(xué)術(shù)會(huì)議論文匯編[C];2011年

9 邊翼;;12例老年頑固性心絞痛患者的發(fā)病因素與治療體會(huì)[A];中國保健醫(yī)學(xué)研究會(huì)心臟學(xué)學(xué)會(huì)全國第一屆心臟學(xué)學(xué)術(shù)會(huì)議論文匯編[C];1995年

中國重要報(bào)紙全文數(shù)據(jù)庫 前10條

1 趙飛;造影正常也要小心心梗[N];農(nóng)村醫(yī)藥報(bào)（漢）;2008年

2 何世楨;不干活就胸痛 冠脈作祟[N];中國中醫(yī)藥報(bào);2006年

3 羅學(xué)宏;氣溫突降易發(fā)心梗[N];大眾衛(wèi)生報(bào);2009年

4 中南大學(xué)湘雅醫(yī)院急診科教授 羅學(xué)宏;有些疾病 隨凍而來[N];健康報(bào);2008年

5 市第四人民醫(yī)院心電圖室 樊麗萍;冬季老年人晨練要注意什么[N];駐馬店日?qǐng)?bào);2011年

6 ;應(yīng)知應(yīng)會(huì)慢性病知識(shí)部分（六）[N];南通日?qǐng)?bào);2007年

7 吳微;心梗后重在自我調(diào)養(yǎng)和護(hù)理[N];保健時(shí)報(bào);2004年

8 蔣月榮 王永亮;冷天，如何遠(yuǎn)離心梗威脅[N];中國醫(yī)藥報(bào);2007年

9 北京軍區(qū)總醫(yī)院主任醫(yī)師 張禹;過量吸煙有害健康[N];中國老年報(bào);2001年

10 高天;防治心絞痛應(yīng)該合理選藥[N];農(nóng)村醫(yī)藥報(bào)（漢）;2007年

中國博士學(xué)位論文全文數(shù)據(jù)庫 前2條

1 周萱;冠狀動(dòng)脈痙攣患者自主神經(jīng)功能及其相關(guān)基因多態(tài)性研究[D];第三軍醫(yī)大學(xué);2013年

2 關(guān)啟剛;炎癥因子介導(dǎo)的小型豬冠狀動(dòng)脈痙攣Rho激酶的作用機(jī)制與通心絡(luò)干預(yù)研究[D];中國醫(yī)科大學(xué);2006年

中國碩士學(xué)位論文全文數(shù)據(jù)庫 前9條

1 曹星梅;在體外模擬冠狀動(dòng)脈痙攣微環(huán)境下下調(diào)Caveolin-1對(duì)人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞分泌NO和ET-1的影響[D];首都醫(yī)科大學(xué);2016年

2 肖云;心理應(yīng)激與冠狀動(dòng)脈痙攣關(guān)系的研究[D];中國醫(yī)科大學(xué);2004年

3 王萌;冠狀動(dòng)脈痙攣誘發(fā)心律失常的動(dòng)物實(shí)驗(yàn)與臨床研究[D];南京醫(yī)科大學(xué);2008年

4 曾菁;內(nèi)皮素-1基因多態(tài)性與冠狀動(dòng)脈痙攣的相關(guān)性研究[D];南方醫(yī)科大學(xué);2011年

5 萬正;橈動(dòng)脈痙攣與冠狀動(dòng)脈痙攣相關(guān)性事件的研究[D];大連醫(yī)科大學(xué);2013年

6 黃子豪;溫陽活血法對(duì)冠狀動(dòng)脈痙攣伴慢性心率加快患者vWF、TM的干預(yù)研究[D];山東中醫(yī)藥大學(xué);2011年

7 馬照琳;溫陽活血法對(duì)冠狀動(dòng)脈痙攣患者h(yuǎn)U-Ⅱ、TM的干預(yù)研究[D];山東中醫(yī)藥大學(xué);2011年

8 閻帥;體外模擬內(nèi)皮功能異常及冠狀動(dòng)脈痙攣微環(huán)境下caveolin-1與NO及ET-1相關(guān)性的研究[D];首都醫(yī)科大學(xué);2015年

9 張玉;應(yīng)用心臟遠(yuǎn)程監(jiān)護(hù)技術(shù)分析靜息性心肌缺血[D];山東大學(xué);2011年

本文編號(hào)：829399