本文關(guān)鍵詞：超聲微泡介導(dǎo)硫化氫傳輸減輕心肌缺血再灌注損傷的研究

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【摘要】：研究背景急性心肌梗死具有很高的發(fā)病率和死亡率。早期有效地恢復(fù)缺血心肌的血流灌注是治療的關(guān)鍵。然而,恢復(fù)缺血心肌血流再灌注的過程中,其本身亦會造成心肌損傷,稱為心肌缺血再灌注損傷(Myocardial Ischemia Reperfusion Injury,MIRI)。動物實驗表明急性心肌梗死再灌注治療后,梗死心肌中約有50%歸因于MIRI.因此,減輕MIRI具有重要的臨床意義。MIRI的發(fā)生機(jī)制復(fù)雜,迄今未完全闡明,可能的機(jī)制包括氧化應(yīng)激損傷、細(xì)胞內(nèi)鈣離子超載、心肌能量代謝障礙、心肌細(xì)胞凋亡、炎癥反應(yīng)和pH反常等。目前,有不少研究致力于探索MIRI的防治策略,包括物理方法干預(yù)(如缺血預(yù)處理、缺血后處理、遠(yuǎn)處缺血適應(yīng)和低溫療法等)和藥物干預(yù)(如腺苷、心房鈉尿肽、促紅細(xì)胞生成素、艾塞那肽、環(huán)孢素A、亞硝酸鹽等)兩種。盡管在動物實驗中發(fā)現(xiàn)很多治療策略在MIRI中發(fā)揮心臟保護(hù)作用,但在臨床轉(zhuǎn)化過程中未能使患者獲益。近期研究發(fā)現(xiàn),硫化氫(Hydrogen Sulfide,H2S)是繼一氧化碳和一氧化氮之后的第三種氣體信號分子,在心血管系統(tǒng)發(fā)揮著重要的生物學(xué)作用,在MIRI防護(hù)方面尤為突出。在哺乳動物心肌中,H2S主要是通過胱硫醚-γ-裂解酶(cystathionine-y-lyase,CSE)催化生成。通過敲除小鼠CSE基因減少內(nèi)源性H2S的產(chǎn)生將使心肌梗死而積擴(kuò)大,而小鼠心臟特異性過表達(dá)CSE基因增加內(nèi)源性H2S的生成則可減小心肌梗死面積,改善心功能。外源性給予H2S同樣具有心臟保護(hù)作用。研究報道,小鼠心肌缺血后再灌注即刻心腔注射硫化鈉(H2S的供體),可減小72%的心梗面積,改善心功能。這一結(jié)果在臨床前動物模型豬的心臟上得到進(jìn)一步證實。H2S減輕MIRI的可能機(jī)制涉及：(1)抗氧化作用；(2)保留線粒體的結(jié)構(gòu)和功能；(3)增加心肌細(xì)胞KATP通道的開放頻率；(4)緩解心肌細(xì)胞內(nèi)鈣超載；(5)抑制心肌細(xì)胞凋亡；(6)減輕炎癥反應(yīng)�？傊�,H2S對MIRI有重要的調(diào)節(jié)作用,外源性給予H2S是一種十分有前景的心臟保護(hù)措施。目前,H2S的給藥方法有氣體吸入和供體給藥兩種方法。H2S由于具有難聞的臭雞蛋氣味和對呼吸道刺激性,即使很吸入很低濃度的氣體仍難以耐受。H2S常用的供體是硫氫化鈉和硫化鈉,這兩種供體注射給藥后雖然能在數(shù)秒鐘之內(nèi)迅速增加體內(nèi)的H2S濃度,但由于其降解速度快而難以在局部組織中維持較長時間的有效濃度。此外,不同器官對H2S的敏感性不同,全身給藥可能會產(chǎn)生副反應(yīng),包括血壓的急劇波動、呼吸抑制和中樞神經(jīng)系統(tǒng)毒性。鑒于此,如能實現(xiàn)H2S向心肌定位輸送,則可能在發(fā)揮其心臟保護(hù)作用同時又可避免這種副反應(yīng)。微泡(Microbubble)是臨床上使用的一種超聲造影劑,由生物外殼包裹氣體核心構(gòu)成。微泡在超聲波的作用下會產(chǎn)生空化效應(yīng)。這一現(xiàn)象被廣泛用于藥物和基因的定位傳輸。近年,有研究報道超聲微泡可用于治療性氣體的定位輸送。例如,載NO的微泡可向心肌輸送NO,增加干細(xì)胞向心肌歸巢,促進(jìn)血管新生；載O2的微泡可改善腫瘤的缺氧環(huán)境,增強聲動力治療效果。因此,制備包裹H2S氣體的超聲微泡結(jié)合局部超聲波照射可有助于H2S的定位傳輸,具有很強的可行性,然而,目前仍未見報道。因此,本實驗假設(shè)超聲聯(lián)合微泡可實現(xiàn)H2S信號分子的定位傳輸,從而減輕心肌缺血在灌注損傷,這可能避免H2S全身毒副作用,為防治MIRI提供一種無創(chuàng)方便安全的治療方法。目的①構(gòu)建高H2S載量的穩(wěn)定的載硫化氫微泡(hs-MB)；②探索hs-MB對MIRI的作用及可能機(jī)制。方法1. hs-MB的制備及評價由于H2S為小分子氣體,易于溢出微泡,而C3F8為大分子惰性氣體,可增加微泡的穩(wěn)定性,因此,為了制備具有較高穩(wěn)定性和H2S載量的hs-MB,我們探索了H2S和C3F8最佳的混合比例。采用機(jī)械震蕩法制備5種載不同比例的H2S和C3F8混合氣體(分別為4/0、3/1、2/2、1/3、0/4)的超聲微泡,顯微鏡觀察微泡的形態(tài),測量微泡中H2S的含量；在不同時間點(Oh、1h、6h、24h、 72h)用庫爾特計數(shù)儀測定hs-MB的微泡濃度及粒徑,評估其穩(wěn)定性。根據(jù)微泡濃度、H2S載量和微泡穩(wěn)定性優(yōu)選出最佳的氣體混合比例。2.超聲輻照hs-MB傳輸H2S的實驗研究①.超聲輻照觸發(fā)hs-MB釋放H2S的體外實驗在體外流動腔裝置上,PBS以10ml/min的速度恒速通過,hs-MB以100μl/min泵入,在其下游用超聲空化治療儀發(fā)射的低頻超聲波(發(fā)射頻率1.0MHz,聲壓1.0MPa)進(jìn)行輻照,液體流出口處采用氣體信號分子和生物自由基檢測儀實時檢測液體中H2S濃度。②.超聲破壞hs-MB定位傳輸H2S的在體實驗：9只SD大鼠隨機(jī)分成Control、hs-MB和hs-MB+US組。Control組不予處理;hs-MB組經(jīng)尾靜脈6×109個／(kg·h)泵入hs-MB,持續(xù)30分鐘;hs-MB+US組在泵入hs-MB的同時低頻超聲輻照心前區(qū)。對比超聲檢查觀察hs-MB的成像效果及微泡破壞情況。觀察hs-MB對大鼠血壓心率和呼吸的影響。測量不同器官組織中H2S的濃度。3.超聲破壞hs-MB減輕MIRI的實驗研究72只SD大鼠隨機(jī)分成4組(n=18)：Ⅰ.SHAM組：不拉緊左冠脈結(jié)扎線,經(jīng)尾靜脈6ml/(kg·h)泵入生理鹽水。Ⅱ. MIRI組：拉緊左冠脈結(jié)扎線30min,經(jīng)尾靜脈6ml/(kg·h)泵入生理鹽水。Ⅲ. c-MB+US組：拉緊左冠脈結(jié)扎線30min,經(jīng)尾靜脈6×109個／(kgoh)泵入普通超聲微泡(全氟丙烷內(nèi)核,c-MB)。低頻超聲輻照大鼠心前區(qū)破壞微泡。Ⅳ. hs-MB+US組：拉緊左冠脈結(jié)扎線30min,經(jīng)尾靜脈6×109個／(kg·h)泵入hs-MB。超聲輻照方法和條件與c-MB+US組相同。在缺血心肌再灌注前5分鐘開始給予干預(yù)治療,持續(xù)30分鐘。再灌注4小時后,每組取6只大鼠分別行HE染色和TUNEL染色,取另外6只大鼠測量心肌組織MDA和SOD的濃度。再灌注24小時,行超聲心動圖檢查評估大鼠心功能后處死大鼠取出心臟行TTC/伊文思藍(lán)雙染色檢測心肌缺血及梗死面積。4.統(tǒng)計方法運用SPSS 19.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計學(xué)分析,所有數(shù)值均以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(Mean±SD)表示。多組間比較采用單因素方差分析,Bonferroni進(jìn)行組間多重比較。hs-MB穩(wěn)定性的數(shù)據(jù)采用重復(fù)測量數(shù)據(jù)的方差分析進(jìn)行比較。P0.05認(rèn)為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。結(jié)果1. H2S/C3F8為2/2制備的hs-MB具有較高的穩(wěn)定性和H2S載量。H2S/C3F8為2/2制備的hs-MB穩(wěn)定性良好,H2S載量最高,微泡濃度為(1.01±0.19)×109/mL,粒徑為2.26±0.17μm,分布于0-9μm。2.超聲輻照觸發(fā)hs-MB釋放H2S。體外實驗結(jié)果顯示：在輸注hs-MB前,液體中H2S濃度穩(wěn)定維持在0μM水平；加入hs-MB后,H2S濃度稍有增加；若同時輸注hs-MB和低頻超聲輻照,可觀察到H2S濃度顯著增加并維持在3.5-4.5μM,停止微泡輸注和低頻超聲輻照后,H2S濃度迅速降至基線水平。輸注hs-MB和低頻超聲組液體中H2S濃度最大峰值顯著高于僅輸注hs-MB組(P0.05)。3.超聲破壞hs-MB促進(jìn)H2S的定位傳輸。超聲破壞hs-MB定位傳輸H2S的在體實驗結(jié)果顯示：hs-MB具有良好的超聲顯影能力,經(jīng)靜脈注射后可到達(dá)心肌組織并可被低頻超聲破壞。hs-MB+US處理后,大鼠心肌組織和肺臟組織中H2S含量較對照組升高(均P0.05),而腎臟和肝臟組織中H2S含量無明顯變化(均P0.05)。4. hs-MB+US減小心肌梗死面積。與SHAM組相比,MIRI組IS/AAR顯著擴(kuò)大(P0.01)。MIRI和c-MB+US組IS/AAR無顯著差異(P0.05)。hs-MB+US組IS/AAR明顯小于c-MB+US組(P0.05)。心肌組織HE染色示hs-MB+US組心肌纖維呈波浪狀排列,肌纖維斷裂程度、間隙水腫和炎癥細(xì)胞浸潤程度較c-MB+US組減輕。5. hs-MB+US改善大鼠MIRI后心功能。與SHAM組相比,MIRI組EDd和ESd顯著增加(P0.05),LVFS和LVEF顯著降低(P0.01)。MIRI和c-MB+US組ESd、EDd、LVFS和LVEF無差異(所有P0.05)。與c-MB+US組相比,hs-MB+US組ESd減小(P0.05),LVFS(P0.01)和LVEF(P0.01)明顯改善,但EDd無顯著差異(P0.05)。6. hs-MB+US減輕MIRI后心肌細(xì)胞凋亡。與SHAM組相比,MIRI組凋亡細(xì)胞明顯增加(P0.01)。MIRI和c-MB+US組心肌細(xì)胞凋亡數(shù)目無差異(P0.05)。hs-MB+US組凋亡細(xì)胞數(shù)目明顯少于c-MB+US組(P0.01)。7. hs-MB+US減輕MIRI后氧化應(yīng)激。與SHAM組相比,MIRI組心肌組織中MDA含量增加(P0.01),而SOD含量減低(P0.01)。MIRI和c-MB+US組心肌組織中MDA和SOD含量無差異(P0.05)。hs-MB+US組心肌組織中MDA含量較c-MB+US組減少(P0.05),而SOD含量增加(P0.01)。8. hs-MB+US對大鼠血流動力學(xué)和呼吸的無影響。結(jié)論H2S/C3F8為2/2制備的hs-MB具有較高的穩(wěn)定性和H2S載量,具有良好的超聲顯影效果。超聲破壞hs-MB可釋放H2S并增加心肌H2S濃度。hs-MB+US傳輸H2S信號分子減輕心肌缺血再灌注損傷,改善心功能,這種保護(hù)作用與減少心肌細(xì)胞凋亡和抑制氧化應(yīng)激有關(guān)。超聲聯(lián)合微泡定點傳輸H2S信號分子對血流動力學(xué)和呼吸無影響,可能避免H2S全身毒副作用,是一種減輕心肌缺血再灌注損傷的有前景的治療方法。
【關(guān)鍵詞】：硫化氫 心肌缺血再灌注損傷 微泡 超聲
【學(xué)位授予單位】：南方醫(yī)科大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2016
【分類號】：R542.2
【目錄】：

• 摘要3-9
• ABSTRACT9-17
• 前言17-27
• 方法27-41
• 結(jié)果41-55
• 討論55-60
• 總結(jié)60-61
• 參考文獻(xiàn)61-71
• 縮略詞表71-73
• 碩士研究生期間發(fā)表的文章73-74
• 致謝74-75

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本文編號：823889