發(fā)布時(shí)間：2017-09-09 07:07

  本文關(guān)鍵詞：巨噬細(xì)胞表達(dá)的swiprosin-1在動(dòng)脈粥樣硬化中的作用及其機(jī)制研究

  更多相關(guān)文章： 動(dòng)脈粥樣硬化 swiprosin-1 巨噬細(xì)胞 凋亡 炎癥 自噬

【摘要】：動(dòng)脈粥樣硬化(Atherosclerosis,AS)是累及大、中動(dòng)脈內(nèi)膜的慢性進(jìn)展性炎癥疾病,常造成冠心病、腦卒中等缺血性心血管疾病。動(dòng)脈粥樣硬化的發(fā)病機(jī)制至今尚未完全闡明。巨噬細(xì)胞是斑塊中重要組成部分,目前研究認(rèn)為巨噬細(xì)胞在動(dòng)脈粥樣硬化起始、發(fā)展的全過程中發(fā)揮著重要作用,巨噬細(xì)胞與動(dòng)脈粥樣硬化斑塊中發(fā)生的細(xì)胞凋亡、自噬以及炎癥反應(yīng)等均有密切的關(guān)系。Swiprosin-1是一種新型蛋白,在2004年由瑞士科研人員Vuadens F等首次發(fā)現(xiàn)并報(bào)道,后續(xù)相關(guān)報(bào)道主要圍繞其在淋巴細(xì)胞中的作用及其他免疫相關(guān)功能的研究。本課題組前期研究發(fā)現(xiàn)swiprosin-1表達(dá)在主動(dòng)脈斑塊中,而且發(fā)現(xiàn)其主要表達(dá)在斑塊的巨噬細(xì)胞中。目前未見swiprosin-1在動(dòng)脈粥樣硬化中作用的相關(guān)報(bào)道。我們前期研究發(fā)現(xiàn)敲除swiprosin-1后巨噬細(xì)胞泡沫化程度明顯減弱,由于巨噬細(xì)胞向泡沫細(xì)胞轉(zhuǎn)變是動(dòng)脈粥樣硬化發(fā)病的生理基礎(chǔ),對(duì)動(dòng)脈粥樣硬化嚴(yán)重程度的調(diào)節(jié)具有重要作用,因此,我們推測巨噬細(xì)胞表達(dá)的swiprosin-1在動(dòng)脈粥樣硬化的發(fā)生發(fā)展中發(fā)揮著重要作用。本課題圍繞巨噬細(xì)胞swiprosin-1在動(dòng)脈粥樣硬化發(fā)生、發(fā)展中的作用展開研究,并初步探討其機(jī)制,從而為動(dòng)脈粥樣硬化的治療提供新靶點(diǎn)。方法與結(jié)果:一、Swiprosin-1在動(dòng)脈粥樣硬化斑塊中的表達(dá)及定位1.應(yīng)用組織切片和免疫熒光標(biāo)記技術(shù)標(biāo)記swiprosin-1以及巨噬細(xì)胞,發(fā)現(xiàn)swiprosin-1在斑塊中有表達(dá),且與巨噬細(xì)胞特異標(biāo)記物F4/80共定位。2.應(yīng)用免疫熒光技術(shù)標(biāo)記巨噬細(xì)胞中的swiprosin-1,免疫印跡技術(shù)檢測swiprosin-1在巨噬細(xì)胞中的表達(dá),發(fā)現(xiàn)swiprosin-1主要分布在巨噬細(xì)胞的細(xì)胞質(zhì)以及細(xì)胞膜上,核中無表達(dá),且在巨噬細(xì)胞中的蛋白表達(dá)水平很高。3.應(yīng)用免疫印跡方法檢測主動(dòng)脈中內(nèi)皮層、平滑肌層中swiprosin-1的表達(dá),發(fā)現(xiàn)主動(dòng)脈內(nèi)皮層和平滑肌層均無swiprosin-1表達(dá)。二、Swiprosin-1在動(dòng)脈粥樣硬化整體斑塊中的表達(dá)變化1.給予ApoE~(-/-)小鼠高脂飼養(yǎng),構(gòu)建動(dòng)脈粥樣硬化動(dòng)物模型,取其主動(dòng)脈進(jìn)行免疫組織化學(xué)染色,觀察到動(dòng)脈壁斑塊形成,證明整體造模成功。2.應(yīng)用免疫印跡技術(shù)對(duì)模型組與對(duì)照組主動(dòng)脈中swiprosin-1含量進(jìn)行檢測,發(fā)現(xiàn)與對(duì)照組相比,動(dòng)脈粥樣硬化組小鼠主動(dòng)脈中swiprosin-1蛋白表達(dá)水平增加。三、Swiprosin-1在巨噬細(xì)胞泡沫化中的表達(dá)變化1.Ox-LDL刺激RAW264.7細(xì)胞24 h后油紅染色,構(gòu)建巨噬細(xì)胞泡沫化模型,發(fā)現(xiàn)隨著Ox-LDL的濃度由10μg/m L增加到80μg/m L,巨噬細(xì)胞泡沫化程度加深。2.免疫印跡技術(shù)檢測不同濃度Ox-LDL(10,20,40,80μg/m L)刺激RAW264.7細(xì)胞檢測對(duì)swiprosin-1表達(dá)的影響,發(fā)現(xiàn)隨著給藥濃度的加大,swiprosin-1表達(dá)水平上升,在40μg/m L達(dá)到峰值。3.免疫印跡技術(shù)檢測Ox-LDL刺激RAW264.7細(xì)胞不同時(shí)長(0,6,12,24,48 h)對(duì)于swiprosin-1表達(dá)的影響,結(jié)果顯示隨著刺激時(shí)間的延長,swiprosin-1表達(dá)水平上升,在24 h達(dá)到最高。4.提取小鼠原代腹腔巨噬細(xì)胞,Ox-LDL刺激,進(jìn)行驗(yàn)證,免疫印跡結(jié)果顯示swiprosin-1在巨噬細(xì)胞泡沫化過程中表達(dá)增多。四、敲除swiprosin-1對(duì)于動(dòng)脈粥樣硬化發(fā)展的影響將swiprosin-1~(-/-)以及swiprosin-1~(+/+)小鼠骨髓移植入ApoE~(-/-)小鼠體內(nèi),前者為模型組,后者為對(duì)照組,然后飼以高脂飼料4個(gè)月,構(gòu)建動(dòng)脈粥樣硬化模型。1.將模型組與對(duì)照組小鼠剝離主動(dòng)脈縱向剖開,應(yīng)用油紅O染色法對(duì)主動(dòng)脈斑塊進(jìn)行染色,發(fā)現(xiàn)swiprosin-1敲除組斑塊明顯少于對(duì)照組。2.應(yīng)用冰凍切片技術(shù)橫切主動(dòng)脈組織,油紅O染色法對(duì)主動(dòng)脈切片進(jìn)行染色,結(jié)果同樣顯示swiprosin-1敲除組斑塊面積較對(duì)照組小。3.應(yīng)用免疫組織化學(xué)方法標(biāo)記動(dòng)脈粥樣硬化斑塊中巨噬細(xì)胞,發(fā)現(xiàn)與對(duì)照組相比,敲除swiprosin-1小鼠動(dòng)脈粥樣硬化造模之后,斑塊中巨噬細(xì)胞含量減少。4.取模型小鼠血清進(jìn)行血脂檢測,發(fā)現(xiàn)與對(duì)照組相比,敲除swiprosin-1之后,小鼠血清中膽固醇含量降低。五、敲除swiprosin-1對(duì)于巨噬細(xì)胞泡沫化的影響分別從swiprosin-1~(-/-)以及swiprosin-1~(+/+)小鼠中提取原代腹腔巨噬細(xì)胞,前者作為模型組,后者為對(duì)照組。1.Ox-LDL刺激造模,應(yīng)用油紅O染色,發(fā)現(xiàn)與對(duì)照組相比,敲除swiprosin-1的巨噬細(xì)胞泡沫化程度降低。2.Ox-LDL刺激造模,進(jìn)行膽固醇檢測,發(fā)現(xiàn)與對(duì)照組相比,敲除swiprosin-1的巨噬細(xì)胞膽固醇含量降低。3.利用熒光標(biāo)記檢測膽固醇流出,結(jié)果顯示過表達(dá)swiprosin-1之后,巨噬細(xì)胞膽固醇流出減少。4.檢測巨噬細(xì)胞對(duì)熒光標(biāo)記氧化型低密度脂蛋白的吞噬,發(fā)現(xiàn)敲除swiprosin-1之后,巨噬細(xì)胞吞噬脂質(zhì)功能增強(qiáng)。六、Swiprosin-1影響動(dòng)脈粥樣硬化發(fā)展可能的機(jī)制分別從swiprosin-1~(-/-)以及swiprosin-1~(+/+)小鼠中提取原代腹腔巨噬細(xì)胞,前者作為模型組,后者為對(duì)照組。1.應(yīng)用免疫印跡技術(shù)檢測巨噬細(xì)胞中凋亡相關(guān)蛋白的表達(dá),結(jié)果顯示敲除swiprosin-1之后,促凋亡相關(guān)蛋白Bax、caspase3、caspase9含量減少,抑凋亡蛋白Bcl-2表達(dá)增加。進(jìn)而采用Annexin V-FITC細(xì)胞凋亡檢測試劑盒以及TUNEL法檢測細(xì)胞凋亡情況,結(jié)果均顯示敲除swiprosin-1之后,巨噬細(xì)胞凋亡顯著減少(7.93±1.52%vs 0.41±0.12%)。2.利用Elisa試劑盒檢測血清以及巨噬細(xì)胞培養(yǎng)液上清中炎癥因子的含量,發(fā)現(xiàn)敲除swiprosin-1之后,炎癥因子IL-1β、TNF-α水平均出現(xiàn)降低。3.應(yīng)用免疫印跡技術(shù)檢測自噬相關(guān)蛋白表達(dá),發(fā)現(xiàn)敲除swiprosin-1之后,巨噬細(xì)胞LC3表達(dá)上升,P62表達(dá)下降,提示巨噬細(xì)胞自噬功能可能增強(qiáng)。4.應(yīng)用Transwell遷移技術(shù)檢測巨噬細(xì)胞遷移能力,發(fā)現(xiàn)敲除swiprosin-1之后,巨噬細(xì)胞遷移能力下調(diào)。結(jié)論:1.Swiprosin-1在動(dòng)脈粥樣硬化斑塊內(nèi)的巨噬細(xì)胞中高表達(dá),且隨著泡沫化程度加重而表達(dá)增加;2.Swiprosin-1抑制了巨噬細(xì)胞對(duì)于氧化型低密度脂蛋白的吞噬;3.Swiprosin-1抑制了巨噬細(xì)胞自噬進(jìn)程;4.Swiprosin-1促進(jìn)了巨噬細(xì)胞凋亡、遷移以及炎癥因子的分泌;5.巨噬細(xì)胞缺失swiprosin-1能夠抑制動(dòng)脈粥樣硬化的發(fā)生發(fā)展。
【關(guān)鍵詞】：動(dòng)脈粥樣硬化 swiprosin-1 巨噬細(xì)胞 凋亡 炎癥 自噬
【學(xué)位授予單位】：第二軍醫(yī)大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2016
【分類號(hào)】：R543.5
【目錄】：

• 摘要6-9
• Abstract9-14
• 縮略詞表14-15
• 前言15-16
• 第一章 Swiprosin-1 在動(dòng)脈粥樣硬化中的表達(dá)變化16-39
• 一、實(shí)驗(yàn)材料及試劑16-20
• （一）試劑16-18
• （二）儀器設(shè)備18-20
• 二、實(shí)驗(yàn)方法20-30
• 三、實(shí)驗(yàn)結(jié)果30-39
• 第二章 Swiprosin-1 在動(dòng)脈粥樣硬化中的作用39-57
• 一、實(shí)驗(yàn)材料及試劑39-40
• 二、實(shí)驗(yàn)方法40-45
• 三、實(shí)驗(yàn)結(jié)果45-57
• 討論57-60
• 參考文獻(xiàn)60-63
• 綜述63-74
• 參考文獻(xiàn)70-74
• 在讀期間發(fā)表論文及參加科研情況74-75
• 致謝75

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本文編號(hào)：819000