本文關(guān)鍵詞：E1A激活基因阻遏子基因調(diào)控自噬溶酶體通路改善心肌缺血再灌注損傷的作用研究

  更多相關(guān)文章： CREG MIR 損傷 心功能 凋亡 自噬

【摘要】：目的:E1A激活基因阻遏子(Cellular repressor of E1A-stimulated genes,CREG)是一個(gè)小分子量糖蛋白,前期的研究已經(jīng)證實(shí)在心肌肥大和心肌纖維化中CREG過表達(dá)能夠改善心功能,但CREG對(duì)心肌缺血再灌注(myocardial ischemia reperfusion,MIR)損傷的作用未見報(bào)道。后續(xù)研究發(fā)現(xiàn),CREG作為溶酶體相關(guān)蛋白,可能參與調(diào)控溶酶體的形成。因此,本文的目的是闡明CREG能否通過調(diào)控自噬溶酶體發(fā)生,改善MIR損傷。方法:(1)在南方動(dòng)物模型研究中心購買CREG基因半敲除的小鼠模型即CREG雜合子(CREG+/-)小鼠,在本實(shí)驗(yàn)室繼續(xù)飼養(yǎng)、繁殖。C57BL/6(CREG+/+)小鼠由沈陽軍區(qū)總醫(yī)院動(dòng)物實(shí)驗(yàn)科提供。(2)通過CREG+/+小鼠皮下埋微滲透泵給予外源性重組CREG蛋白(re CREG)(0.3 mg/kg·day)建立CREG過表達(dá)組小鼠模型即re CREG+/+小鼠,通過給予溶酶體抑制劑Chloroquine(CQ,10 mg/kg·day)建立自噬損傷小鼠模型。(3)應(yīng)用上述不同組小鼠模型通過結(jié)扎前降支缺血30 min,再灌注不同時(shí)間,建立小鼠MIR模型。(4)應(yīng)用腺病毒載體和干擾RNA方法轉(zhuǎn)染H9C2心肌細(xì)胞,建立CREG過表達(dá)和低表達(dá)的H9C2心肌細(xì)胞培養(yǎng)模型。(5)應(yīng)用小動(dòng)物超聲儀于再灌注28 d檢測各組小鼠的心功能,TTC(2,3,5-氯化三苯基四氮唑)染色檢測心肌缺血情況。(6)應(yīng)用RT-PCR方法檢測CREG m RNA水平的表達(dá)。(7)應(yīng)用蛋白印跡方法(western blot)和原位末端轉(zhuǎn)移酶標(biāo)記技術(shù)(TUNEL)檢測心肌細(xì)胞凋亡的情況。(8)應(yīng)用western blot和免疫熒光染色的方法檢測自噬相關(guān)蛋白的表達(dá)。結(jié)果:通過western blot和RT-PCR方法研究發(fā)現(xiàn),MIR后15 min開始,正常CREG+/+小鼠心肌中CREG蛋白的表達(dá)逐漸下降,2 h基本消失。CREG的m RNA水平無明顯改變。在CREG+/-小鼠心肌中CREG蛋白表達(dá)下降更為明顯(P0.05)。在re CREG蛋白治療組中,re CREG+/+小鼠心肌中CREG蛋白未見顯著下調(diào)。應(yīng)用小動(dòng)物超聲儀檢測小鼠MIR 28 d時(shí)的心功能發(fā)現(xiàn):與CREG+/+小鼠相比較,CREG+/-小鼠的心功能損傷更為嚴(yán)重(P0.05),而re CREG+/+小鼠心功能改善比較明顯(P0.05)。MIR 24h行TTC染色觀察到CREG+/-小鼠的心肌壞死面積最大(P0.01),給予re CREG蛋白能夠改善CREG+/+小鼠心肌受損現(xiàn)象,這些結(jié)果提示CREG能夠改善MIR損傷時(shí)的心肌損傷,明顯改善心功能。與CREG+/+小鼠相比較,MIR后CREG+/-小鼠心肌凋亡現(xiàn)象嚴(yán)重(P0.01),而re CREG+/+小鼠心肌細(xì)胞凋亡改善(P0.01);免疫熒光染色和western blot結(jié)果證實(shí)CREG+/-小鼠MIR早期自噬功能損傷嚴(yán)重,而給予re CREG蛋白時(shí)能夠激活自噬通路。這些結(jié)果表明CREG參與凋亡和自噬的調(diào)控作用。為進(jìn)一步證實(shí)CREG是否通過調(diào)控自噬通路對(duì)抗心肌細(xì)胞凋亡,我們?cè)诮o予re CREG蛋白的同時(shí)給予溶酶體抑制劑CQ(10 mg/kg·day),TUNEL染色和western blot分析發(fā)現(xiàn),抑制心肌自噬后,給予re CREG蛋白干預(yù)組心肌細(xì)胞凋亡較自噬未抑制組明顯加重(P0.05)。小動(dòng)物超聲儀檢測28 d的心功能發(fā)現(xiàn):給予re CREG蛋白并同時(shí)給予CQ組小鼠的心功能較單獨(dú)給予re CREG蛋白組明顯惡化。這些研究提示,CREG可能通過調(diào)控自噬激活作用保護(hù)缺血再灌注(ischemia reperfusion,IR)引起的細(xì)胞凋亡,從而保護(hù)心功能。為深入探討CREG調(diào)控自噬的分子機(jī)制,我們應(yīng)用腺病毒和干擾RNA轉(zhuǎn)染分別建立了CREG過表達(dá)(Ad CREG)和低表達(dá)(si CREG)的大鼠心肌細(xì)胞H9C2體外培養(yǎng)模型。分別給予早期自噬激動(dòng)劑Resveratrol(Res,10μmol/L)和CQ(10μmol/L),然后饑餓處理細(xì)胞后,觀察CREG對(duì)心肌細(xì)胞凋亡和自噬的調(diào)控作用。結(jié)果表明:Ad CREG組細(xì)胞凋亡較Ad GFP對(duì)照組減少,同時(shí),心肌細(xì)胞自噬功能活躍;給予CQ后心肌自噬功能受到抑制,細(xì)胞凋亡明顯加重(P0.01);與CREG正常表達(dá)的對(duì)照組相比,si CREG心肌細(xì)胞自噬發(fā)生障礙,細(xì)胞凋亡嚴(yán)重,應(yīng)用Res后不能改善心肌細(xì)胞凋亡現(xiàn)象(P0.01),而對(duì)照組給予Res后心肌細(xì)胞凋亡減輕,自噬被激活。這些結(jié)果在細(xì)胞水平再次證實(shí)了CREG通過調(diào)控自噬對(duì)抗心肌細(xì)胞凋亡。進(jìn)一步應(yīng)用透射電鏡觀察到,給予饑餓刺激后Ad CREG細(xì)胞中自噬體和溶酶體形成增加(P0.01);而si CREG細(xì)胞中自噬體顯著堆積,溶酶體形成顯著減少(P0.01)。Lysotracker染色結(jié)果同樣提示CREG過表達(dá)促進(jìn)了細(xì)胞內(nèi)溶酶體數(shù)量的增加,而CREG的缺乏使溶酶體的生成減少。并且,si CREG細(xì)胞中溶酶體膜蛋白LAMP1/LAMP2、溶酶體內(nèi)蛋白水解酶cathepsin D/cathepsin L表達(dá)下降(P0.01),而Ad CREG細(xì)胞中這四種蛋白顯著增多。這些發(fā)現(xiàn)說明了CREG可能參與了溶酶體的發(fā)生及功能,激活自噬通路。甘露糖-6-磷酸受體(Mannose 6-phosphate receptors,M6P/IGF2R)是重要的溶酶體酶轉(zhuǎn)運(yùn)受體,促進(jìn)溶酶體的成熟發(fā)育。IGF2R也是CREG的受體,因此,我們假設(shè)在CREG參與溶酶體發(fā)生及成熟的過程中,IGF2R發(fā)揮重要的作用。研究發(fā)現(xiàn),si CREG細(xì)胞中IGF2R蛋白的表達(dá)量較對(duì)照組和Ad CREG組明顯增多;免疫熒光染色和免疫共沉淀檢測到CREG的缺乏降低了IGF2R與LAMP2、cathepsin D的相互結(jié)合能力,減少了溶酶體酶的轉(zhuǎn)運(yùn);而CREG過表達(dá)則提高了IGF2R與LAMP2、cathepsin D的結(jié)合能力。結(jié)果提示CREG與IGF2R相互作用,促進(jìn)溶酶體的成熟。結(jié)論:CREG通過促進(jìn)溶酶體發(fā)生及功能,激活自噬,對(duì)抗心肌細(xì)胞凋亡,保護(hù)MIR損傷引起的心功能障礙。
【關(guān)鍵詞】：CREG MIR 損傷 心功能 凋亡 自噬
【學(xué)位授予單位】：第四軍醫(yī)大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2015
【分類號(hào)】：R542.2
【目錄】：

• 縮略語表6-7
• 中文摘要7-10
• ABSTRACT10-13
• 前言13-15
• 文獻(xiàn)回顧15-21
• 1 自噬在心臟中的研究進(jìn)展15-19
• 1.1 自噬的概述15
• 1.2 自噬在心臟調(diào)控中具有重要作用15-19
• 1.3 小結(jié)19
• 2 CREG概述及在心血管方面的最新研究進(jìn)展19-21
• 2.1 CREG的簡介19-20
• 2.2 CREG在心血管方面的研究進(jìn)展20
• 2.3 小結(jié)20-21
• 實(shí)驗(yàn)一 MIR時(shí)CREG蛋白的表達(dá)變化及與凋亡、自噬的相關(guān)性研究21-30
• 1 材料21-24
• 1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物21
• 1.2 主要儀器和設(shè)備21-22
• 1.3 主要試劑22-23
• 1.4 試劑配制23-24
• 2 方法24-26
• 2.1 建立小鼠MIR模型[93]24
• 2.2 IR后心肌的凋亡檢測24-25
• 2.3 免疫熒光染色25
• 2.4 應(yīng)用小動(dòng)物超聲檢測心功能[94]25
• 2.5 TTC染色[95]25
• 2.6 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析25-26
• 3 結(jié)果26-29
• 3.1 MIR后CREG蛋白表達(dá)下降26-27
• 3.2 CREG蛋白表達(dá)調(diào)控MIR引起的心功能損傷27
• 3.3 MIR后心肌凋亡情況27-28
• 3.4 MIR后心肌自噬的表達(dá)情況28-29
• 4 討論29-30
• 實(shí)驗(yàn)二 MIR時(shí)CREG對(duì)凋亡和自噬的調(diào)控作用研究30-36
• 1 材料30-32
• 1.1 主要儀器和設(shè)備30-31
• 1.2 主要試劑31
• 1.3 試劑配制31-32
• 2 方法32
• 2.1 同時(shí)給予外源重組CREG蛋白和CQ32
• 2.2 TUNEL染色、免疫熒光染色、western blot方法同試驗(yàn)一32
• 2.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析32
• 3 結(jié)果32-34
• 3.1 同時(shí)給予外源性重組CREG蛋白和CQ后，，缺血再灌注心肌組織中自噬蛋白的表達(dá)32-33
• 3.2 同時(shí)給予re CREG蛋白和CQ后，IR心肌組織中凋亡的檢測33-34
• 3.3 抑制自噬后，檢測MIR28 d的心功能34
• 4 討論34-36
• 實(shí)驗(yàn)三 CREG調(diào)控自噬對(duì)抗凋亡的細(xì)胞學(xué)機(jī)制研究36-47
• 1 材料36-37
• 1.1 主要儀器和設(shè)備36
• 1.2 主要試劑36-37
• 1.3 試劑配制37
• 2 方法37-39
• 2.1 在H9C2心肌細(xì)胞系上建立CREG過表達(dá)模型[98]37-38
• 2.2 在H9C2心肌細(xì)胞系上建立CREG低表達(dá)的模型[98]38
• 2.3 處理不同的細(xì)胞模型[98]38
• 2.4 TUNEL染色38
• 2.5 Western blot檢測方法38
• 2.6 免疫熒光染色38-39
• 2.7 免疫共沉淀（Immunoprecipitation, IP）39
• 2.8 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析39
• 3 結(jié)果39-44
• 3.1 在H9C2心肌細(xì)胞上成功建立CREG低表達(dá)和過表達(dá)模型39-40
• 3.2 CREG低表達(dá)時(shí)凋亡和自噬的表達(dá)情況40-41
• 3.3 CREG高表達(dá)時(shí)凋亡和自噬的表達(dá)情況41-42
• 3.4 觀察心肌細(xì)胞中自噬體和溶酶體的表達(dá)42-43
• 3.5 CREG與IGF2R的相互作用43-44
• 4 討論44-47
• 小結(jié)47-48
• 參考文獻(xiàn)48-58
• 個(gè)人簡歷和研究成果58-59
• 致謝59

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