發(fā)布時(shí)間：2017-08-23 13:31

  本文關(guān)鍵詞：新型DNA-RNA納米載體的構(gòu)建及其調(diào)控肺動(dòng)脈內(nèi)皮細(xì)胞生長(zhǎng)及機(jī)制的研究

  更多相關(guān)文章： 肺動(dòng)脈高壓 DNA納米材料 ATG101siRNA 自噬 增殖和凋亡失衡

【摘要】：研究背景:肺動(dòng)脈高壓(Pulmonary arterial hypertension,PAH)是以肺血管壓力增高為其主要特征的一類(lèi)臨床綜合征,是慢性阻塞性肺疾病、肺心病等臨床肺部疾病的重要病理生理基礎(chǔ)。而低氧肺動(dòng)脈高壓是(HPH)是PAH臨床分類(lèi)的主要類(lèi)型之一,其主要的病理改變是低氧刺激肺血管平滑肌細(xì)胞和內(nèi)膜組織的異常增生,導(dǎo)致血管腔的狹窄,肺血管阻力增高及肺血管的重構(gòu)。研究表明,肺動(dòng)脈內(nèi)皮細(xì)胞(Pulmonary artery endothelial cells,PAECs)的功能紊亂是該病發(fā)生及發(fā)展的關(guān)鍵環(huán)節(jié),目前認(rèn)為內(nèi)皮功能紊亂主要包括內(nèi)皮細(xì)胞凋亡抑制,增殖增加,那么為尋求HPH的治療靶點(diǎn),我們將內(nèi)皮細(xì)胞在低氧條件下增殖調(diào)控的具體機(jī)制作為研究的重點(diǎn),探索HPH治療的新方法。自噬(autophagy)是細(xì)胞內(nèi)自體吞噬的一個(gè)過(guò)程,在正常的生理狀態(tài)下,它有利于細(xì)胞維持自身穩(wěn)態(tài),當(dāng)位于應(yīng)激的狀況時(shí),如低氧、饑餓條件,自噬狀態(tài)的改變將影響細(xì)胞里的穩(wěn)定狀態(tài),影響細(xì)胞的增殖、凋亡、周期、遷移或侵襲等。自噬是低氧下內(nèi)皮細(xì)胞的一個(gè)重要調(diào)控因素,而ATG101是調(diào)控自噬的重要基因。本文旨在探索低氧對(duì)PAECs自噬的影響及其對(duì)增殖調(diào)控的具體機(jī)制。針對(duì)臨床上的常見(jiàn)病及難治病,傳統(tǒng)的藥物治療,往往是對(duì)癥治療,有著藥物副作用大,而且會(huì)再次發(fā)作等問(wèn)題,為了滿足人們?nèi)找嬖龈叩闹委熜枨?針對(duì)DNA水平上的新型治療方式應(yīng)運(yùn)而生,基因治療(gene therapy)是往機(jī)體或細(xì)胞中導(dǎo)入工作基因來(lái)達(dá)到預(yù)想的治療目的。包括:小干擾RNA、非編碼RNA,mi RNA等。那么如何將si RNA高效地轉(zhuǎn)運(yùn),已成為我們面臨的主要難題之一。而納米系統(tǒng)作為運(yùn)載體已越來(lái)越受到人們重視,相對(duì)與傳統(tǒng)的病毒類(lèi)載體,納米系統(tǒng),尤其是DNA、RNA等天然的生物分子為材料的納米載體,存在免疫原性非常低,易生物降解,低毒或無(wú)毒,結(jié)構(gòu)穩(wěn)定,合成簡(jiǎn)單等優(yōu)點(diǎn),是非病毒運(yùn)載系統(tǒng)中最重要的一種新型運(yùn)載方式。把DNA作為支架,自組裝合成三角板狀的納米載體,并采用DNA-RNA雜交技術(shù),將運(yùn)載目的基因ATG101si RNA以互補(bǔ)配對(duì)的方式組裝入DNA納米三角板,形成新型DNA-RNA納米運(yùn)載系統(tǒng)。研究其在細(xì)胞內(nèi)的轉(zhuǎn)運(yùn)情況,并探索目的基因?qū)Φ脱鯒l件下的PAECs自噬和增殖的影響,及其調(diào)控的分子機(jī)制,提供防治PAH的新理論依據(jù)和治療方法。研究目的:自組裝能夠攜帶ATG101si RNA的DNA納米三角板,檢測(cè)其胞內(nèi)轉(zhuǎn)染效率,并研究納米系統(tǒng)對(duì)PAECs自噬和增殖的影響。研究方法:1.制備能夠攜帶ATG101si RNA的DNA納米三角板(ATG101si RNA-TNP)并研究其納米系統(tǒng)的特性。(1)采用水浴階梯降溫的方法制備DNA納米三角板攜帶ATG101si RNA(2)采用原子力顯微鏡、凝膠電泳觀察制備的納米體系的超微結(jié)構(gòu)及合成效率。2.攜帶靶蛋白si RNA的DNA納米三角板在肺癌細(xì)胞內(nèi)攝取及轉(zhuǎn)染效率的檢測(cè)。體外培養(yǎng)肺癌細(xì)胞(A549,H292),DNA納米系統(tǒng)轉(zhuǎn)染A549、H292后,采用激光共聚焦及流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)肺癌細(xì)胞對(duì)DNA納米系統(tǒng)攝取的時(shí)間和劑量的依賴性;應(yīng)用RT-PCR及Western blot檢測(cè)靶蛋白表達(dá)情況。3.攜帶ATG101si RNA的DNA納米三角板對(duì)A549細(xì)胞生長(zhǎng)的影響ATG101si RNA-TNP納米系統(tǒng)轉(zhuǎn)染A549細(xì)胞,電鏡、激光共聚焦、WB檢測(cè)細(xì)胞自噬水平的變化,MTT的方法檢測(cè)活力,凋亡用流式細(xì)胞術(shù)(FCM)來(lái)檢測(cè)。4.攜帶靶蛋白ATG101si RNA的DNA納米三角板對(duì)PAECs生長(zhǎng)的影響體外培養(yǎng)肺動(dòng)脈內(nèi)皮細(xì)胞(Pulmonary artery endothelial cells,PAECs),ATG101si RNA-TNP納米系統(tǒng)轉(zhuǎn)染PAECs后,激光共聚焦觀察自噬熒光表達(dá);Western blot檢測(cè)自噬及增殖標(biāo)志蛋白的表達(dá)。5.攜帶靶蛋白ATG101si RNA的DNA納米三角板對(duì)低氧條件PAECs生長(zhǎng)的影響體外培養(yǎng)PAECs,放置于低氧孵育箱中(1%O2、5%CO2、94%N2)中,并用ATG101si RNA-TNP納米系統(tǒng)轉(zhuǎn)染PAECs,分別檢測(cè)納米載藥系統(tǒng)對(duì)細(xì)胞自噬、增殖及凋亡的影響。6.ATG101是通過(guò)Hedgehog信號(hào)通路來(lái)調(diào)控低氧下PAECs的凋亡ATG101si RNA-TNP納米系統(tǒng)轉(zhuǎn)染PAECs后,采用Western blot檢測(cè)ATG101沉默后,信號(hào)通路蛋白Hedgehog,Gli的表達(dá)研究結(jié)果:1.成功自組裝構(gòu)建以單鏈DNA作為骨架,si RNA單鏈為載體的DNA納米三角板,原子力顯微鏡觀察示:三角形的納米結(jié)構(gòu),且分布均勻;凝膠電泳結(jié)果分析:水浴階梯降溫法自組裝合成的納米系統(tǒng)產(chǎn)率高,結(jié)構(gòu)穩(wěn)定。2.腫瘤細(xì)胞系的體系穩(wěn)定,因此以兩種肺癌的細(xì)胞作為預(yù)實(shí)驗(yàn)對(duì)象,結(jié)果是兩種肺癌細(xì)胞(H292,A549)均能攝取DNA納米系統(tǒng),且相對(duì)于單獨(dú)的si RNA,納米材料攜帶的si RNA更易被細(xì)胞攝取,并且具有時(shí)間及濃度依賴性,激光共聚焦和流式細(xì)胞術(shù)結(jié)果均顯示隨著濃度和時(shí)間的增加,其轉(zhuǎn)染效率增強(qiáng);納米系統(tǒng)是巨胞飲及網(wǎng)格蛋白介導(dǎo)的胞吞的路徑進(jìn)入細(xì)胞。納米材料攜帶的si RNA能高效進(jìn)入細(xì)胞并發(fā)揮其生物學(xué)效應(yīng),RT-PCR和Western blot結(jié)果顯示在m RNA及蛋白水平靶蛋白的表達(dá)明顯下降。3.ATG101si RNA-TNP轉(zhuǎn)染入A549細(xì)胞,抑制ATG101的表達(dá)后,抑制細(xì)胞自噬,激活了凋亡,從而導(dǎo)致A549細(xì)胞生長(zhǎng)抑制。4.攜帶靶蛋白ATG101si RNA的DNA納米三角板能被PAECs高效攝入,并沉默靶蛋白ATG101,其效應(yīng)有時(shí)間和濃度依賴性;激光共聚焦及Western blot結(jié)果均顯示抑制靶蛋白后,明顯抑制自噬水平,同時(shí)抑制細(xì)胞生長(zhǎng)。5.低氧條件下,PAECs的自噬及增殖水平升高,激光共聚焦及Western blot顯示沉默ATG101后,自噬水平下降,MTT結(jié)果表明細(xì)胞PAECs生長(zhǎng)受到抑制,FCM檢測(cè)發(fā)現(xiàn)激活了細(xì)胞凋亡。6.低氧條件下,沉默ATG101抑制細(xì)胞自噬后,是通過(guò)Hedgehog-GLi信號(hào)通路來(lái)激活PAECs的凋亡,從而抑制細(xì)胞生長(zhǎng)。結(jié)論:1.成功自組裝合成能夠攜帶ATG101si RNA的DNA納米三角板,合成產(chǎn)物產(chǎn)率高,結(jié)構(gòu)穩(wěn)定,此納米系統(tǒng)可以成功且高效的轉(zhuǎn)入腫瘤細(xì)胞及正常細(xì)胞中,并且發(fā)揮si RNA的生物學(xué)效應(yīng),說(shuō)明此納米體系穩(wěn)定,具有廣泛的應(yīng)用前景。2.DNA納米三角板攜帶ATG101si RNA進(jìn)入A549,細(xì)胞自噬水平受到抑制,凋亡激活,最終導(dǎo)致細(xì)胞生長(zhǎng)受到了抑制。3.DNA納米三角板攜帶ATG101si RNA進(jìn)入PAECs,能抑制低氧條件下細(xì)胞自噬水平,并通過(guò)Hedgehog-GLi信號(hào)通路誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡,從而導(dǎo)致PAECs生長(zhǎng)抑制,說(shuō)明autophagy可以調(diào)節(jié)低氧條件PAECs增殖和凋亡的失衡。
【關(guān)鍵詞】：肺動(dòng)脈高壓 DNA納米材料 ATG101siRNA 自噬 增殖和凋亡失衡
【學(xué)位授予單位】：第三軍醫(yī)大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2016
【分類(lèi)號(hào)】：R544.1
【目錄】：

• 縮略語(yǔ)表4-5
• 英文摘要5-9
• 中文摘要9-12
• 前言12-14
• 第一章 新型DNA-RNA納米載體的設(shè)計(jì)及組裝14-21
• 1.1 實(shí)驗(yàn)材料與方法15-18
• 1.2 結(jié)果18-20
• 1.3 討論20
• 1.4 小結(jié)20-21
• 第二章 自組裝的DNA納米三角板是一個(gè)安全高效的基因運(yùn)載體21-53
• 2.1 自組裝DNA納米三角板的胞內(nèi)安全高效攝入22-44
• 2.2 DNA納米載體攜帶ATG101siRNA對(duì)肺癌細(xì)胞的影響44-53
• 第三章 新型DNA納米載體攜帶ATG101siRNA對(duì)肺動(dòng)脈內(nèi)皮細(xì)胞生長(zhǎng)的影響及機(jī)制的研究53-73
• 3.1 實(shí)驗(yàn)材料與方法54-58
• 3.2 結(jié)果58-71
• 3.3 討論71-72
• 3.4 小結(jié)72-73
• 全文結(jié)論73-74
• 參考文獻(xiàn)74-79
• 文獻(xiàn)綜述 內(nèi)皮功能失衡與肺血管重構(gòu)79-89
• 參考文獻(xiàn)85-89
• 在讀期間發(fā)表的論文89-90
• 致謝90

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