本文關(guān)鍵詞：新型DNA-RNA納米載體的構(gòu)建及其調(diào)控肺動脈內(nèi)皮細胞生長及機制的研究

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【摘要】：研究背景:肺動脈高壓(Pulmonary arterial hypertension,PAH)是以肺血管壓力增高為其主要特征的一類臨床綜合征,是慢性阻塞性肺疾病、肺心病等臨床肺部疾病的重要病理生理基礎。而低氧肺動脈高壓是(HPH)是PAH臨床分類的主要類型之一,其主要的病理改變是低氧刺激肺血管平滑肌細胞和內(nèi)膜組織的異常增生,導致血管腔的狹窄,肺血管阻力增高及肺血管的重構(gòu)。研究表明,肺動脈內(nèi)皮細胞(Pulmonary artery endothelial cells,PAECs)的功能紊亂是該病發(fā)生及發(fā)展的關(guān)鍵環(huán)節(jié),目前認為內(nèi)皮功能紊亂主要包括內(nèi)皮細胞凋亡抑制,增殖增加,那么為尋求HPH的治療靶點,我們將內(nèi)皮細胞在低氧條件下增殖調(diào)控的具體機制作為研究的重點,探索HPH治療的新方法。自噬(autophagy)是細胞內(nèi)自體吞噬的一個過程,在正常的生理狀態(tài)下,它有利于細胞維持自身穩(wěn)態(tài),當位于應激的狀況時,如低氧、饑餓條件,自噬狀態(tài)的改變將影響細胞里的穩(wěn)定狀態(tài),影響細胞的增殖、凋亡、周期、遷移或侵襲等。自噬是低氧下內(nèi)皮細胞的一個重要調(diào)控因素,而ATG101是調(diào)控自噬的重要基因。本文旨在探索低氧對PAECs自噬的影響及其對增殖調(diào)控的具體機制。針對臨床上的常見病及難治病,傳統(tǒng)的藥物治療,往往是對癥治療,有著藥物副作用大,而且會再次發(fā)作等問題,為了滿足人們?nèi)找嬖龈叩闹委熜枨?針對DNA水平上的新型治療方式應運而生,基因治療(gene therapy)是往機體或細胞中導入工作基因來達到預想的治療目的。包括:小干擾RNA、非編碼RNA,mi RNA等。那么如何將si RNA高效地轉(zhuǎn)運,已成為我們面臨的主要難題之一。而納米系統(tǒng)作為運載體已越來越受到人們重視,相對與傳統(tǒng)的病毒類載體,納米系統(tǒng),尤其是DNA、RNA等天然的生物分子為材料的納米載體,存在免疫原性非常低,易生物降解,低毒或無毒,結(jié)構(gòu)穩(wěn)定,合成簡單等優(yōu)點,是非病毒運載系統(tǒng)中最重要的一種新型運載方式。把DNA作為支架,自組裝合成三角板狀的納米載體,并采用DNA-RNA雜交技術(shù),將運載目的基因ATG101si RNA以互補配對的方式組裝入DNA納米三角板,形成新型DNA-RNA納米運載系統(tǒng)。研究其在細胞內(nèi)的轉(zhuǎn)運情況,并探索目的基因?qū)Φ脱鯒l件下的PAECs自噬和增殖的影響,及其調(diào)控的分子機制,提供防治PAH的新理論依據(jù)和治療方法。研究目的:自組裝能夠攜帶ATG101si RNA的DNA納米三角板,檢測其胞內(nèi)轉(zhuǎn)染效率,并研究納米系統(tǒng)對PAECs自噬和增殖的影響。研究方法:1.制備能夠攜帶ATG101si RNA的DNA納米三角板(ATG101si RNA-TNP)并研究其納米系統(tǒng)的特性。(1)采用水浴階梯降溫的方法制備DNA納米三角板攜帶ATG101si RNA(2)采用原子力顯微鏡、凝膠電泳觀察制備的納米體系的超微結(jié)構(gòu)及合成效率。2.攜帶靶蛋白si RNA的DNA納米三角板在肺癌細胞內(nèi)攝取及轉(zhuǎn)染效率的檢測。體外培養(yǎng)肺癌細胞(A549,H292),DNA納米系統(tǒng)轉(zhuǎn)染A549、H292后,采用激光共聚焦及流式細胞術(shù)檢測肺癌細胞對DNA納米系統(tǒng)攝取的時間和劑量的依賴性;應用RT-PCR及Western blot檢測靶蛋白表達情況。3.攜帶ATG101si RNA的DNA納米三角板對A549細胞生長的影響ATG101si RNA-TNP納米系統(tǒng)轉(zhuǎn)染A549細胞,電鏡、激光共聚焦、WB檢測細胞自噬水平的變化,MTT的方法檢測活力,凋亡用流式細胞術(shù)(FCM)來檢測。4.攜帶靶蛋白ATG101si RNA的DNA納米三角板對PAECs生長的影響體外培養(yǎng)肺動脈內(nèi)皮細胞(Pulmonary artery endothelial cells,PAECs),ATG101si RNA-TNP納米系統(tǒng)轉(zhuǎn)染PAECs后,激光共聚焦觀察自噬熒光表達;Western blot檢測自噬及增殖標志蛋白的表達。5.攜帶靶蛋白ATG101si RNA的DNA納米三角板對低氧條件PAECs生長的影響體外培養(yǎng)PAECs,放置于低氧孵育箱中(1%O2、5%CO2、94%N2)中,并用ATG101si RNA-TNP納米系統(tǒng)轉(zhuǎn)染PAECs,分別檢測納米載藥系統(tǒng)對細胞自噬、增殖及凋亡的影響。6.ATG101是通過Hedgehog信號通路來調(diào)控低氧下PAECs的凋亡ATG101si RNA-TNP納米系統(tǒng)轉(zhuǎn)染PAECs后,采用Western blot檢測ATG101沉默后,信號通路蛋白Hedgehog,Gli的表達研究結(jié)果:1.成功自組裝構(gòu)建以單鏈DNA作為骨架,si RNA單鏈為載體的DNA納米三角板,原子力顯微鏡觀察示:三角形的納米結(jié)構(gòu),且分布均勻;凝膠電泳結(jié)果分析:水浴階梯降溫法自組裝合成的納米系統(tǒng)產(chǎn)率高,結(jié)構(gòu)穩(wěn)定。2.腫瘤細胞系的體系穩(wěn)定,因此以兩種肺癌的細胞作為預實驗對象,結(jié)果是兩種肺癌細胞(H292,A549)均能攝取DNA納米系統(tǒng),且相對于單獨的si RNA,納米材料攜帶的si RNA更易被細胞攝取,并且具有時間及濃度依賴性,激光共聚焦和流式細胞術(shù)結(jié)果均顯示隨著濃度和時間的增加,其轉(zhuǎn)染效率增強;納米系統(tǒng)是巨胞飲及網(wǎng)格蛋白介導的胞吞的路徑進入細胞。納米材料攜帶的si RNA能高效進入細胞并發(fā)揮其生物學效應,RT-PCR和Western blot結(jié)果顯示在m RNA及蛋白水平靶蛋白的表達明顯下降。3.ATG101si RNA-TNP轉(zhuǎn)染入A549細胞,抑制ATG101的表達后,抑制細胞自噬,激活了凋亡,從而導致A549細胞生長抑制。4.攜帶靶蛋白ATG101si RNA的DNA納米三角板能被PAECs高效攝入,并沉默靶蛋白ATG101,其效應有時間和濃度依賴性;激光共聚焦及Western blot結(jié)果均顯示抑制靶蛋白后,明顯抑制自噬水平,同時抑制細胞生長。5.低氧條件下,PAECs的自噬及增殖水平升高,激光共聚焦及Western blot顯示沉默ATG101后,自噬水平下降,MTT結(jié)果表明細胞PAECs生長受到抑制,FCM檢測發(fā)現(xiàn)激活了細胞凋亡。6.低氧條件下,沉默ATG101抑制細胞自噬后,是通過Hedgehog-GLi信號通路來激活PAECs的凋亡,從而抑制細胞生長。結(jié)論:1.成功自組裝合成能夠攜帶ATG101si RNA的DNA納米三角板,合成產(chǎn)物產(chǎn)率高,結(jié)構(gòu)穩(wěn)定,此納米系統(tǒng)可以成功且高效的轉(zhuǎn)入腫瘤細胞及正常細胞中,并且發(fā)揮si RNA的生物學效應,說明此納米體系穩(wěn)定,具有廣泛的應用前景。2.DNA納米三角板攜帶ATG101si RNA進入A549,細胞自噬水平受到抑制,凋亡激活,最終導致細胞生長受到了抑制。3.DNA納米三角板攜帶ATG101si RNA進入PAECs,能抑制低氧條件下細胞自噬水平,并通過Hedgehog-GLi信號通路誘導細胞凋亡,從而導致PAECs生長抑制,說明autophagy可以調(diào)節(jié)低氧條件PAECs增殖和凋亡的失衡。
【關(guān)鍵詞】：肺動脈高壓 DNA納米材料 ATG101siRNA 自噬 增殖和凋亡失衡
【學位授予單位】：第三軍醫(yī)大學
【學位級別】：碩士
【學位授予年份】：2016
【分類號】：R544.1
【目錄】：

• 縮略語表4-5
• 英文摘要5-9
• 中文摘要9-12
• 前言12-14
• 第一章 新型DNA-RNA納米載體的設計及組裝14-21
• 1.1 實驗材料與方法15-18
• 1.2 結(jié)果18-20
• 1.3 討論20
• 1.4 小結(jié)20-21
• 第二章 自組裝的DNA納米三角板是一個安全高效的基因運載體21-53
• 2.1 自組裝DNA納米三角板的胞內(nèi)安全高效攝入22-44
• 2.2 DNA納米載體攜帶ATG101siRNA對肺癌細胞的影響44-53
• 第三章 新型DNA納米載體攜帶ATG101siRNA對肺動脈內(nèi)皮細胞生長的影響及機制的研究53-73
• 3.1 實驗材料與方法54-58
• 3.2 結(jié)果58-71
• 3.3 討論71-72
• 3.4 小結(jié)72-73
• 全文結(jié)論73-74
• 參考文獻74-79
• 文獻綜述 內(nèi)皮功能失衡與肺血管重構(gòu)79-89
• 參考文獻85-89
• 在讀期間發(fā)表的論文89-90
• 致謝90

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