本文關(guān)鍵詞：糖尿病心肌缺血易損性增加的新機(jī)制：QKI的減少促進(jìn)FoxO1介導(dǎo)的硝基應(yīng)激，，內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激

  更多相關(guān)文章： 糖尿病 缺血/再灌注損傷 FoxO1 RNA結(jié)合蛋白QKI5

【摘要】：研究背景:隨著人們生活水平的提高,糖尿病患病率呈現(xiàn)逐年增長的趨勢。糖尿病患者主要死于心血管疾病,其中又以缺血性心臟病(IHD)為主。更為嚴(yán)重的是,糖尿病患者發(fā)生缺血性心臟病后心肌損傷程度明顯加重,呈現(xiàn)缺血易損狀態(tài)。研究顯示,糖尿病心肌中Fox O1的活化可通過激活硝基應(yīng)激和內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激加重糖尿病心肌缺血/再灌注損傷,但具體上游信號機(jī)制尚不清楚,可能與內(nèi)源性保護(hù)機(jī)制的減弱有關(guān)。該問題的研究將為臨床指導(dǎo)糖尿病缺血性心臟病的診治提供一定的實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)。Quaking5(QKI5)是STAR家族(Signal Transduction and Activators of RNAs)成員之一,可通過與m RNA 3’UTR區(qū)結(jié)合調(diào)控m RNA的轉(zhuǎn)錄后功能。本課題組前期研究發(fā)現(xiàn),QKI5在心肌缺血/再灌注處理中通過抑制Fox O1的表達(dá)減少心肌損傷。這提示,QKI5具有抗心肌/.缺血再灌注損傷的保護(hù)作用。但是,QKI5在糖尿病心肌中的作用,及其是否參與糖尿病心肌缺血易損性的增加尚未見任何報(bào)道。實(shí)驗(yàn)?zāi)康?探討QKI5與糖尿病心肌缺血易損性增加的機(jī)制,初步闡明QKI5在糖尿病心肌缺血/再灌注(I/R)中保護(hù)作用及意義。實(shí)驗(yàn)方法:本研究采用雄性ob/ob小鼠及正常C57BL/6小鼠分別隨機(jī)分為假手術(shù)組(Sham)、缺血/再灌注組(I/R,30min/4h),比較兩組小鼠心肌缺血再灌注損傷后心肌梗死面積、凋亡、QKI5及Fox O1表達(dá)、硝化應(yīng)激和內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激水平。通過檢測血清LDH水平,i NOS,e NOS表達(dá)及磷酸化水平,Caspase3活性,以及總NO和硝基酪氨酸生成量評估硝化應(yīng)激水平。通過檢測PERK、e IF-2α、CHOP、IRE1a及GRP78的表達(dá)及磷酸化水平評估內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激水平。測定心肌內(nèi)注射敲除Fox O1及導(dǎo)入QKI5重組腺病毒載體后MI/R前后糖尿病小鼠心肌上述指標(biāo)的變化情況。實(shí)驗(yàn)結(jié)果:1.與C57BL/6小鼠相比,ob/ob小鼠具有糖尿病小鼠模型的特征,表現(xiàn)為:體重、心重、脂肪含量、脛骨長短以及心重/脛骨長短明顯增加、糖耐量顯著下降。此外,ob/ob小鼠(12周)心肌呈現(xiàn)I/R損傷加重,其心肌梗死面積及乳酸脫氫酶(LDH)水平均增加。2.ob/ob小鼠心肌中Fox O1表達(dá)明顯升高,處于激活狀態(tài)。通過比較C57BL/6小鼠及ob/ob小鼠心肌細(xì)胞核Fox O1、細(xì)胞漿Fox O1及總的Fox O1水平,可見ob/ob小鼠心肌中有活性的Fox O1水平明顯增高,提示ob/ob小鼠心肌中Fox O1的激活可能與糖尿病心肌I/R損傷加重有關(guān)。3.為進(jìn)一步研究糖尿病心肌缺血/再灌注損傷敏感性增加的機(jī)制,實(shí)驗(yàn)對WT及ob/ob小鼠非缺血/再灌注處理?xiàng)l件下的硝基應(yīng)激水平進(jìn)行測定。結(jié)果發(fā)現(xiàn),ob/ob小鼠心肌細(xì)胞中總NO含量及硝基酪氨酸生成量增加,i NOS表達(dá)顯著上調(diào),e NOS磷酸化水平下降,而其表達(dá)無明顯變化。上述結(jié)果表明,糖尿病心肌中硝化應(yīng)激水平增強(qiáng)。更為重要的是,給予ob/ob小鼠心肌I/R處理后,心肌損傷程度明顯加重,若于再灌注前給予硝基應(yīng)激抑制劑,可見心肌I/R損傷程度有所減輕,但并非完全恢復(fù)。以上結(jié)果表明,糖尿病心肌中活化的硝化應(yīng)激是糖尿病缺血易損性增加的重要因素,但還可能存在其他潛在加重糖尿病心肌缺血/再灌注損傷的機(jī)制。4.實(shí)驗(yàn)對比WT及ob/ob小鼠心肌細(xì)胞中內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激水平,結(jié)果顯示,ob/ob小鼠心肌細(xì)胞中內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激處于激活狀態(tài),即p-PERK、p-e IF2α、CHOP水平顯著增高。通過檢測ob/ob小鼠心肌I/R后凋亡水平,發(fā)現(xiàn)ob/ob+I/R組小鼠心肌Caspase-12及Caspase-3水平明顯增加,且增高的Caspase-12可以被內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激抑制劑SAL抑制,但增加的Caspase-3只能部分被SAL抑制。這提示,糖尿病狀態(tài)下激活的內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激參與糖尿病心肌缺血易損性的增加有關(guān),但活化的內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激部分參與糖尿病心肌I/R損傷。為了進(jìn)一步觀察糖尿病狀態(tài)下活化的內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激與活化的硝基應(yīng)激通路是否相互影響,實(shí)驗(yàn)給予腹腔注射硝基應(yīng)激抑制劑1400W/M40401并檢測內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激指標(biāo)以及給予腹腔注射內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激抑制劑SAL并檢測硝基酪氨酸含量。以上實(shí)驗(yàn)結(jié)果提示糖尿病狀態(tài)下,心肌缺血易損性增加,且硝化應(yīng)激及內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激是增加心肌缺血易損性的獨(dú)立因素。5.為了進(jìn)一步驗(yàn)證糖尿病心肌中活化的內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激和硝基應(yīng)激及其引起的I/R損傷加重與糖尿病心肌中過度激活的Fox O1間的關(guān)系,實(shí)驗(yàn)采用心肌病毒點(diǎn)注射Fox O1 si RNA的方法下調(diào)ob/ob小鼠心肌Fox O1的表達(dá)。結(jié)果發(fā)現(xiàn),糖尿病心肌中硝基應(yīng)激及內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激水平被明顯抑制、心肌I/R損傷也減輕。這提示,糖尿病心肌中Fox O1的活化與硝基應(yīng)激及內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激的激活有關(guān),并參與糖尿病心肌缺血易損性的發(fā)生。6.為闡明糖尿病心肌中Fox O1激活與QKI5表達(dá)改變的關(guān)系,實(shí)驗(yàn)首先檢測糖尿病心肌中QKI5的表達(dá)情況,結(jié)果顯示,ob/ob小鼠心肌中QKI5表達(dá)明顯降低。在此基礎(chǔ)上,采用心肌病毒點(diǎn)注射Ad-QKI5的方法使ob/ob小鼠心肌過表達(dá)的QKI5并檢測其Fox O1、硝化應(yīng)激及內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激的水平變化。結(jié)果表明,過表達(dá)QKI5可以抑制ob/ob小鼠心肌Fox O1的活化及其下游硝基應(yīng)激和內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激的過度激活。為了進(jìn)一步研究糖尿病心肌中過表達(dá)的QKI5是否可通過抑制Fox O1起到保護(hù)心臟的作用,實(shí)驗(yàn)對比了ob/ob+I/R+Ad-QKI5小鼠組及ob/ob+I/R+vehicle小鼠組Fox O1表達(dá)水平、心臟功能、心肌凋亡水平以及心肌梗死面積。結(jié)果表明,過表達(dá)QKI5可降低改善ob/ob小鼠Fox O1表達(dá),改善心臟功能、減少心肌損傷和死亡。7.為進(jìn)一步闡明QKI5對Fox O1表達(dá)的抑制機(jī)制。實(shí)驗(yàn)采用RNA-IP技術(shù)檢測發(fā)現(xiàn),QKI5可以結(jié)合于Fox O1 m RNA。進(jìn)而在心肌細(xì)胞過表達(dá)QKI5后給予轉(zhuǎn)錄抑制劑(actinomycin D)并觀察Fox O1m RNA的代謝情況。結(jié)果顯示,過表達(dá)QKI5組心肌細(xì)胞內(nèi)的Fox O1m RNA的半衰期明顯縮短。這提示,QKI5是通過與Fox O1m RNA結(jié)合使其穩(wěn)定性降低加速其降解,進(jìn)而抑制Fox O1蛋白的表達(dá)。結(jié)論1.糖尿病心肌中QKI5的減少導(dǎo)致Fox O1過度激活,從而引起糖尿病心肌缺血/再灌注損傷的加重。2.糖尿病心肌可通過過表達(dá)QKI5實(shí)現(xiàn)對Fox O1的抑制,這種抑制作用是通過促進(jìn)Fox O1 m RNA降解實(shí)現(xiàn)的。3.糖尿病心肌Fox O1的激活參與糖尿病心肌缺血易損性的增加主要是通過激活其下游的硝基應(yīng)激和內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激實(shí)現(xiàn)的。
【關(guān)鍵詞】：糖尿病 缺血/再灌注損傷 FoxO1 RNA結(jié)合蛋白QKI5
【學(xué)位授予單位】：第四軍醫(yī)大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2015
【分類號】：R587.2;R542.2
【目錄】：

• 縮略語表5-7
• 中文摘要7-11
• 英文摘要11-15
• 前言15-16
• 文獻(xiàn)回顧16-24
• 1 材料24-27
• 1.1 實(shí)驗(yàn)動物24
• 1.2 主要儀器24-25
• 1.3 主要試劑25-27
• 2 方法27-34
• 2.1 實(shí)驗(yàn)分組及實(shí)驗(yàn)流程27-28
• 2.2 空腹葡萄糖耐量測試（IPGTT）28
• 2.3 胰島素敏感性檢測（IST）28
• 2.4 急性心肌缺血/再灌注模型制備28-29
• 2.5 小鼠心功能測定29
• 2.6 心肌梗死面積測定29
• 2.7 免疫熒光檢測凋亡29-30
• 2.8 Caspase-3 活性檢測30
• 2.9 硝基酪氨酸含量測定30-31
• 2.10 NO含量檢測31
• 2.11 血清乳酸脫氫酶（LDH）活性檢測31
• 2.12 蛋白免疫印跡檢測31-32
• 2.13 乳鼠原代心肌細(xì)胞培養(yǎng)32-33
• 2.14 離體細(xì)胞腺病毒感染33
• 2.15 RNA-Immprecipitation33-34
• 2.16 RT-PCR34
• 2.17統(tǒng)計(jì)分析34
• 3 結(jié)果34-47
• 3.1 糖尿病小鼠心肌缺血易損性增強(qiáng)34-35
• 3.2 糖尿病心肌Fox O1處于活化狀態(tài)35
• 3.3 糖尿病心肌中硝基應(yīng)激過度激活35-36
• 3.4 糖尿病心肌內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激過度激活36
• 3.5 下調(diào)Fox O1可以提高糖尿病心肌的缺血耐受36-37
• 3.6 上調(diào)QKI5抑制Fox O1對糖尿病心肌的缺血易損性37-38
• 3.7 QKI5通過降低Fox O1m RNA的穩(wěn)定性促進(jìn)Fox O1降解38-47
• 4 討論47-51
• 小結(jié)51-52
• 參考文獻(xiàn)52-59
• 個(gè)人簡歷和研究成果59-60
• 致謝60

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本文編號：716024