本文關鍵詞：糖尿病心肌缺血易損性增加的新機制：QKI的減少促進FoxO1介導的硝基應激，，內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應激

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【摘要】：研究背景:隨著人們生活水平的提高,糖尿病患病率呈現(xiàn)逐年增長的趨勢。糖尿病患者主要死于心血管疾病,其中又以缺血性心臟病(IHD)為主。更為嚴重的是,糖尿病患者發(fā)生缺血性心臟病后心肌損傷程度明顯加重,呈現(xiàn)缺血易損狀態(tài)。研究顯示,糖尿病心肌中Fox O1的活化可通過激活硝基應激和內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應激加重糖尿病心肌缺血/再灌注損傷,但具體上游信號機制尚不清楚,可能與內(nèi)源性保護機制的減弱有關。該問題的研究將為臨床指導糖尿病缺血性心臟病的診治提供一定的實驗基礎。Quaking5(QKI5)是STAR家族(Signal Transduction and Activators of RNAs)成員之一,可通過與m RNA 3’UTR區(qū)結合調(diào)控m RNA的轉(zhuǎn)錄后功能。本課題組前期研究發(fā)現(xiàn),QKI5在心肌缺血/再灌注處理中通過抑制Fox O1的表達減少心肌損傷。這提示,QKI5具有抗心肌/.缺血再灌注損傷的保護作用。但是,QKI5在糖尿病心肌中的作用,及其是否參與糖尿病心肌缺血易損性的增加尚未見任何報道。實驗目的:探討QKI5與糖尿病心肌缺血易損性增加的機制,初步闡明QKI5在糖尿病心肌缺血/再灌注(I/R)中保護作用及意義。實驗方法:本研究采用雄性ob/ob小鼠及正常C57BL/6小鼠分別隨機分為假手術組(Sham)、缺血/再灌注組(I/R,30min/4h),比較兩組小鼠心肌缺血再灌注損傷后心肌梗死面積、凋亡、QKI5及Fox O1表達、硝化應激和內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應激水平。通過檢測血清LDH水平,i NOS,e NOS表達及磷酸化水平,Caspase3活性,以及總NO和硝基酪氨酸生成量評估硝化應激水平。通過檢測PERK、e IF-2α、CHOP、IRE1a及GRP78的表達及磷酸化水平評估內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應激水平。測定心肌內(nèi)注射敲除Fox O1及導入QKI5重組腺病毒載體后MI/R前后糖尿病小鼠心肌上述指標的變化情況。實驗結果:1.與C57BL/6小鼠相比,ob/ob小鼠具有糖尿病小鼠模型的特征,表現(xiàn)為:體重、心重、脂肪含量、脛骨長短以及心重/脛骨長短明顯增加、糖耐量顯著下降。此外,ob/ob小鼠(12周)心肌呈現(xiàn)I/R損傷加重,其心肌梗死面積及乳酸脫氫酶(LDH)水平均增加。2.ob/ob小鼠心肌中Fox O1表達明顯升高,處于激活狀態(tài)。通過比較C57BL/6小鼠及ob/ob小鼠心肌細胞核Fox O1、細胞漿Fox O1及總的Fox O1水平,可見ob/ob小鼠心肌中有活性的Fox O1水平明顯增高,提示ob/ob小鼠心肌中Fox O1的激活可能與糖尿病心肌I/R損傷加重有關。3.為進一步研究糖尿病心肌缺血/再灌注損傷敏感性增加的機制,實驗對WT及ob/ob小鼠非缺血/再灌注處理條件下的硝基應激水平進行測定。結果發(fā)現(xiàn),ob/ob小鼠心肌細胞中總NO含量及硝基酪氨酸生成量增加,i NOS表達顯著上調(diào),e NOS磷酸化水平下降,而其表達無明顯變化。上述結果表明,糖尿病心肌中硝化應激水平增強。更為重要的是,給予ob/ob小鼠心肌I/R處理后,心肌損傷程度明顯加重,若于再灌注前給予硝基應激抑制劑,可見心肌I/R損傷程度有所減輕,但并非完全恢復。以上結果表明,糖尿病心肌中活化的硝化應激是糖尿病缺血易損性增加的重要因素,但還可能存在其他潛在加重糖尿病心肌缺血/再灌注損傷的機制。4.實驗對比WT及ob/ob小鼠心肌細胞中內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應激水平,結果顯示,ob/ob小鼠心肌細胞中內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應激處于激活狀態(tài),即p-PERK、p-e IF2α、CHOP水平顯著增高。通過檢測ob/ob小鼠心肌I/R后凋亡水平,發(fā)現(xiàn)ob/ob+I/R組小鼠心肌Caspase-12及Caspase-3水平明顯增加,且增高的Caspase-12可以被內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應激抑制劑SAL抑制,但增加的Caspase-3只能部分被SAL抑制。這提示,糖尿病狀態(tài)下激活的內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應激參與糖尿病心肌缺血易損性的增加有關,但活化的內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應激部分參與糖尿病心肌I/R損傷。為了進一步觀察糖尿病狀態(tài)下活化的內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應激與活化的硝基應激通路是否相互影響,實驗給予腹腔注射硝基應激抑制劑1400W/M40401并檢測內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應激指標以及給予腹腔注射內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應激抑制劑SAL并檢測硝基酪氨酸含量。以上實驗結果提示糖尿病狀態(tài)下,心肌缺血易損性增加,且硝化應激及內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應激是增加心肌缺血易損性的獨立因素。5.為了進一步驗證糖尿病心肌中活化的內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應激和硝基應激及其引起的I/R損傷加重與糖尿病心肌中過度激活的Fox O1間的關系,實驗采用心肌病毒點注射Fox O1 si RNA的方法下調(diào)ob/ob小鼠心肌Fox O1的表達。結果發(fā)現(xiàn),糖尿病心肌中硝基應激及內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應激水平被明顯抑制、心肌I/R損傷也減輕。這提示,糖尿病心肌中Fox O1的活化與硝基應激及內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應激的激活有關,并參與糖尿病心肌缺血易損性的發(fā)生。6.為闡明糖尿病心肌中Fox O1激活與QKI5表達改變的關系,實驗首先檢測糖尿病心肌中QKI5的表達情況,結果顯示,ob/ob小鼠心肌中QKI5表達明顯降低。在此基礎上,采用心肌病毒點注射Ad-QKI5的方法使ob/ob小鼠心肌過表達的QKI5并檢測其Fox O1、硝化應激及內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應激的水平變化。結果表明,過表達QKI5可以抑制ob/ob小鼠心肌Fox O1的活化及其下游硝基應激和內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應激的過度激活。為了進一步研究糖尿病心肌中過表達的QKI5是否可通過抑制Fox O1起到保護心臟的作用,實驗對比了ob/ob+I/R+Ad-QKI5小鼠組及ob/ob+I/R+vehicle小鼠組Fox O1表達水平、心臟功能、心肌凋亡水平以及心肌梗死面積。結果表明,過表達QKI5可降低改善ob/ob小鼠Fox O1表達,改善心臟功能、減少心肌損傷和死亡。7.為進一步闡明QKI5對Fox O1表達的抑制機制。實驗采用RNA-IP技術檢測發(fā)現(xiàn),QKI5可以結合于Fox O1 m RNA。進而在心肌細胞過表達QKI5后給予轉(zhuǎn)錄抑制劑(actinomycin D)并觀察Fox O1m RNA的代謝情況。結果顯示,過表達QKI5組心肌細胞內(nèi)的Fox O1m RNA的半衰期明顯縮短。這提示,QKI5是通過與Fox O1m RNA結合使其穩(wěn)定性降低加速其降解,進而抑制Fox O1蛋白的表達。結論1.糖尿病心肌中QKI5的減少導致Fox O1過度激活,從而引起糖尿病心肌缺血/再灌注損傷的加重。2.糖尿病心肌可通過過表達QKI5實現(xiàn)對Fox O1的抑制,這種抑制作用是通過促進Fox O1 m RNA降解實現(xiàn)的。3.糖尿病心肌Fox O1的激活參與糖尿病心肌缺血易損性的增加主要是通過激活其下游的硝基應激和內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應激實現(xiàn)的。
【關鍵詞】：糖尿病 缺血/再灌注損傷 FoxO1 RNA結合蛋白QKI5
【學位授予單位】：第四軍醫(yī)大學
【學位級別】：碩士
【學位授予年份】：2015
【分類號】：R587.2;R542.2
【目錄】：

• 縮略語表5-7
• 中文摘要7-11
• 英文摘要11-15
• 前言15-16
• 文獻回顧16-24
• 1 材料24-27
• 1.1 實驗動物24
• 1.2 主要儀器24-25
• 1.3 主要試劑25-27
• 2 方法27-34
• 2.1 實驗分組及實驗流程27-28
• 2.2 空腹葡萄糖耐量測試（IPGTT）28
• 2.3 胰島素敏感性檢測（IST）28
• 2.4 急性心肌缺血/再灌注模型制備28-29
• 2.5 小鼠心功能測定29
• 2.6 心肌梗死面積測定29
• 2.7 免疫熒光檢測凋亡29-30
• 2.8 Caspase-3 活性檢測30
• 2.9 硝基酪氨酸含量測定30-31
• 2.10 NO含量檢測31
• 2.11 血清乳酸脫氫酶（LDH）活性檢測31
• 2.12 蛋白免疫印跡檢測31-32
• 2.13 乳鼠原代心肌細胞培養(yǎng)32-33
• 2.14 離體細胞腺病毒感染33
• 2.15 RNA-Immprecipitation33-34
• 2.16 RT-PCR34
• 2.17統(tǒng)計分析34
• 3 結果34-47
• 3.1 糖尿病小鼠心肌缺血易損性增強34-35
• 3.2 糖尿病心肌Fox O1處于活化狀態(tài)35
• 3.3 糖尿病心肌中硝基應激過度激活35-36
• 3.4 糖尿病心肌內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應激過度激活36
• 3.5 下調(diào)Fox O1可以提高糖尿病心肌的缺血耐受36-37
• 3.6 上調(diào)QKI5抑制Fox O1對糖尿病心肌的缺血易損性37-38
• 3.7 QKI5通過降低Fox O1m RNA的穩(wěn)定性促進Fox O1降解38-47
• 4 討論47-51
• 小結51-52
• 參考文獻52-59
• 個人簡歷和研究成果59-60
• 致謝60

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本文編號：716024