本文關(guān)鍵詞：冠狀動(dòng)脈粥樣硬化斑塊形成相關(guān)的靶點(diǎn)基因的探索及其功能與機(jī)制的研究

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【摘要】：研究背景及目的：冠狀動(dòng)脈粥樣硬化性心臟病是由多種原因引起的常見疾病,近年其發(fā)病率在不斷上升。冠狀動(dòng)脈內(nèi)粥樣硬化斑塊的形成及其破裂和血栓形成,是引起急性心血管事件的主要原因。目前除了對(duì)肥胖,吸煙,高血壓,糖尿病,高脂血癥等傳統(tǒng)的危險(xiǎn)因素的研究外,人們對(duì)冠狀動(dòng)脈粥樣硬化斑塊形成相關(guān)的靶點(diǎn)基因的研究越來越重視。肌細(xì)胞增強(qiáng)因子2A(MEF2A)基因是第一個(gè)被發(fā)現(xiàn)的引起冠狀動(dòng)脈性心臟病CHD和心肌梗死MI的致病基因,隨后越來越多的關(guān)于MEF2A基因突變所致的冠狀動(dòng)脈粥樣硬化性心臟病的研究出現(xiàn)。我們對(duì)一有家族性冠心病發(fā)病現(xiàn)象的家庭進(jìn)行了調(diào)查,發(fā)現(xiàn)該家族患病成員均有MEF2A基因第11外顯子"CAGCCG"六個(gè)堿基的缺失。MEF2A基因功能的異常導(dǎo)致了CHD和MI的發(fā)生。炎癥參與動(dòng)脈粥樣硬化斑塊形成和發(fā)展過程,可誘導(dǎo)分泌多種細(xì)胞因子,如TNF-α, IL-6等。巨噬細(xì)胞在調(diào)節(jié)動(dòng)脈粥樣硬化斑塊內(nèi)炎癥方面起著至關(guān)重要的作用。經(jīng)典活化激活的巨噬細(xì)胞(M1)促進(jìn)炎癥的發(fā)展,替代活化激活的巨噬細(xì)胞(M2)抑制炎癥發(fā)展。通過調(diào)控巨噬細(xì)胞功能可以改善動(dòng)脈粥樣硬化斑塊的形成和進(jìn)展。精氨酸酶-1(Arg-1)能促進(jìn)平滑肌細(xì)胞增殖并抑制炎癥,高表達(dá)于M2型巨噬細(xì)胞,能抑制巨噬細(xì)胞炎癥反應(yīng),減少腫瘤壞死因子-α (TNF-α)的生成和單核細(xì)胞的趨化遷移,還能減弱動(dòng)脈粥樣硬化斑塊內(nèi)的炎癥反應(yīng)從而穩(wěn)定斑塊,我們之前的研究已充分證實(shí)Arg-1在冠狀動(dòng)脈粥樣硬化斑塊中的作用。通過對(duì)Arg-1上游調(diào)控基因的探索,可以發(fā)現(xiàn)與動(dòng)脈粥樣硬化相關(guān)的新的調(diào)控基因,通過新基因的探索及對(duì)其功能的研究可以找到新的冠心病干預(yù)靶點(diǎn),對(duì)疾病的研究具有重要意義。在上述研究的基礎(chǔ)上,我們提出如下假設(shè)：(1)篩選與精氨酸酶1啟動(dòng)子活性區(qū)域結(jié)合的轉(zhuǎn)錄因子,以發(fā)現(xiàn)與MEF2A調(diào)控冠狀動(dòng)脈粥樣硬化斑塊形成類似的新的靶點(diǎn)基因。(2)探討新發(fā)現(xiàn)的靶點(diǎn)基因在動(dòng)脈粥樣硬化斑塊炎癥反應(yīng)中的作用及機(jī)制。本研究基于發(fā)現(xiàn)MEF2A基因功能異常導(dǎo)致家族性冠狀動(dòng)脈粥樣硬化性心臟病的研究,以之前對(duì)Arg-1的研究為基礎(chǔ)。旨在探索調(diào)控斑塊炎癥反應(yīng)的新靶點(diǎn)基因,驗(yàn)證并明確白細(xì)胞介素增強(qiáng)結(jié)合因子3(Interleukin enhancer-binding factor 3, ILF-3)為Arg-1的轉(zhuǎn)錄因子,并對(duì)其功能進(jìn)行研究,以期找到與冠狀動(dòng)脈粥樣硬化斑塊炎癥相關(guān)的新預(yù)防和治療靶點(diǎn)。方法：1.細(xì)胞處理：以脂多糖(LPS)作為炎癥誘導(dǎo)劑,以干擾素γ(IFN-γ)+LPS和白細(xì)胞介素4(IL-4)作為巨噬細(xì)胞極化分型誘導(dǎo)劑,分別對(duì)細(xì)胞進(jìn)行處理。2. pGL3載體的構(gòu)建：應(yīng)用逐段刪除法進(jìn)行引物設(shè)計(jì),PCR擴(kuò)增得到-560 bp,-510 bp,-460 bp,-410 bp,-360 bp,-310 bp,-260 bp帶有Arg-1啟動(dòng)子片斷的Pgl3-basic多克隆載體。3.細(xì)胞轉(zhuǎn)染：用Arg1-Pgl3質(zhì)粒轉(zhuǎn)染平滑肌細(xì)胞,Arg1-siRNA轉(zhuǎn)染平滑肌細(xì)胞,慢病毒轉(zhuǎn)染小鼠細(xì)胞系Raw264.7細(xì)胞,轉(zhuǎn)染完成后進(jìn)行下一步實(shí)驗(yàn)或檢測(cè)。4.熒光素酶活性的檢測(cè)：制備細(xì)胞裂解液,按照熒光素酶試劑盒說明書處理并及時(shí)用光度計(jì)進(jìn)行檢測(cè),檢測(cè)出高熒光素酶活性片段。5.Arg-1-460bp至-410 bp啟動(dòng)子區(qū)域結(jié)合蛋白的純化和分析鑒定：應(yīng)用DNA結(jié)合蛋白純化試劑盒,純化Arg-1-460 bp至-410 bp啟動(dòng)子區(qū)域的結(jié)合蛋白,經(jīng)胰蛋白酶消化和脫鹽處理后送公司檢進(jìn)行蛋白質(zhì)分析檢測(cè),分析活性區(qū)域的結(jié)合蛋白。6.染色質(zhì)免疫共沉淀(Chromatin immunoprecipitation, ChIP):按試劑盒說明書操作,驗(yàn)證ILF-3是否與Arg-1啟動(dòng)子的活性片段直接結(jié)合。7.熒光實(shí)時(shí)定量RT-PCR檢測(cè)：提取細(xì)胞總RNA,檢測(cè)ILF-3, Arg-1及細(xì)胞炎性因子mRNA的表達(dá)。8. Western blot檢測(cè)：提取細(xì)胞總蛋白,檢測(cè)β-actin, GAPDH, ILF-3, Arg-1, IL-10, TNF-α, IL-6, P38/phospho-P38, JNK/phospho-JNK, ERK/phospho-ERK,核因子-κb(NF-κB)P65的蛋白表達(dá)。9.組織免疫化學(xué)分析：對(duì)人冠狀動(dòng)脈粥樣硬化斑塊石蠟切片進(jìn)行免疫化學(xué)染色,觀察ILF-3在斑塊中的分布。10.免疫熒光實(shí)驗(yàn)分析：用免疫熒光染色及激光共聚焦技術(shù),觀察ILF-3在巨噬細(xì)胞中的定位,以及觀察ILF-3和Arg-1在人冠狀動(dòng)脈和冠脈粥樣硬化斑塊中的定位。研究結(jié)果：1.ILF-3直接結(jié)合于Arg-1啟動(dòng)子的-460bp到-410bp區(qū)域并調(diào)節(jié)精氨酸酶1轉(zhuǎn)錄過程。經(jīng)液相質(zhì)譜儀分析ILF-3結(jié)合于Arg-1啟動(dòng)子上,經(jīng)ChIP驗(yàn)證確定ILF-3可直接結(jié)合于Arg-1啟動(dòng)子,使用ILF-3小干擾RNA抑制ILF-3的蛋白表達(dá)后精氨酸酶1mRNA水平和蛋白質(zhì)水平均下降了70%(p0.01)。2.Raw 264.7細(xì)胞中ILF-3和炎性因子在LPS誘導(dǎo)下的時(shí)間和劑量依賴性表達(dá)。隨著LPS劑量的增加,ILF-3蛋白質(zhì)的表達(dá)開始時(shí)增加達(dá)到峰值然后減少,在1000ng/ml時(shí)出現(xiàn)了下降的趨勢(shì)。隨著LPS刺激時(shí)間的延長,ILF-3表達(dá)量在2 h開始增加,在4 h達(dá)到頂峰。隨后ILF-3表達(dá)開始下降直到第72 h。Arg-1的表達(dá)量在2 h增加,12 h達(dá)頂峰,IL-10在4 h達(dá)到頂峰,之后Arg-1和IL-10都開始下降。3.ILF-3在巨噬細(xì)胞和動(dòng)脈粥樣硬化斑塊中的表達(dá)。在Raw 264.7細(xì)胞中,ILF-3主要分布在細(xì)胞核,特別是核仁。Western blot和激光共焦顯微鏡的結(jié)果表明ILF-3在M1型巨噬細(xì)胞低表達(dá),在M2型巨噬細(xì)胞中高表達(dá)。在動(dòng)脈粥樣硬化斑塊中,ILF-3在斑塊中高表達(dá)并且主要集中在巨噬細(xì)胞中,對(duì)ILF-3和Arg-1免疫熒光雙標(biāo)顯示ILF-3和Arg-1共同表達(dá)于人冠狀動(dòng)脈粥樣硬化斑塊中,并有共定位現(xiàn)象,兩者都在巨噬細(xì)胞高表達(dá)。4.過表達(dá)ILF-3抑制巨噬細(xì)胞中LPS誘導(dǎo)的炎性因子并上調(diào)抗炎細(xì)胞因子。LPS誘導(dǎo)增加了TNF-a, IL-6和1L-1p表達(dá)水平,過表達(dá)ILF-3后TNF-a IL-6和IL-1β明顯減少,而1L-10和Arg-1表達(dá)量與LPS組相比增加了。在過表達(dá)ILF-3但未用LPS刺激時(shí),PCR和Western blot結(jié)果顯示Arg-1和IL-10表達(dá)同樣顯著增加。5.過表達(dá)ILF-3抑制絲裂原激活的蛋白激酶(MAPK) 和 NF-κ B信號(hào)通路的激活。與未作處理細(xì)胞相比,LPS可以增加p-P38, p-JNK, p-ERK,和P65的蛋白表達(dá)。ILF-3過表達(dá)顯著減弱LPS誘導(dǎo)的P65及磷酸化P38和JNK的表達(dá),但沒有減少p-ERK的表達(dá)。結(jié)果表明,ILF-3參與LPS誘導(dǎo)NF-κB和MAPK信號(hào)通路調(diào)節(jié)過程。結(jié)論及意義：1. ILF-3為Arg-1的轉(zhuǎn)錄因子,調(diào)控Arg-1的轉(zhuǎn)錄,為冠狀動(dòng)脈粥樣硬化性斑塊炎癥相關(guān)的新的靶點(diǎn)基因。2. ILF-3高表達(dá)于M2型巨噬細(xì)胞,能增強(qiáng)M2型巨噬細(xì)胞功能。3.ILF-3抑制LPS誘導(dǎo)的巨噬細(xì)胞炎性因子的分泌并促進(jìn)抗炎因子的分泌。4.ILF-3的抑炎作用是通過抑制p-P38/MAPK, p-JNK/MAPK和NF-Kb信號(hào)通路來實(shí)現(xiàn)的。5.我們篩選出了Arg-1的轉(zhuǎn)錄因子ILF-3,并對(duì)ILF-3在冠狀動(dòng)脈粥樣硬化斑塊以及巨噬細(xì)胞中的分布以及細(xì)胞炎性因子分泌中的作用和機(jī)制進(jìn)行了系統(tǒng)研究,ILF-3很可能會(huì)成為與冠狀動(dòng)脈粥樣硬化炎癥相關(guān)的新預(yù)防和治療靶點(diǎn),對(duì)冠狀動(dòng)脈粥樣硬化性心臟病的研究具有重要意義。
【關(guān)鍵詞】：白細(xì)胞介素增強(qiáng)結(jié)合因子3 巨噬細(xì)胞 細(xì)胞因子 核因子-κb 絲裂原激活的蛋白激酶
【學(xué)位授予單位】：山東大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2016
【分類號(hào)】：R541.4
【目錄】：

• 中文摘要6-10
• ABSTRACT10-15
• 英文對(duì)照縮略表15-17
• 前言17-20
• 材料與方法20-31
• 結(jié)果31-35
• 討論35-39
• 實(shí)驗(yàn)結(jié)論39-40
• 附圖40-51
• 參考文獻(xiàn)51-57
• 文獻(xiàn)綜述57-65
• 參考文獻(xiàn)59-65
• 致謝65-66
• 攻讀學(xué)位期間發(fā)表論文66-67
• 學(xué)位論文評(píng)閱及答辯情況表67

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本文編號(hào)：696424