本文關(guān)鍵詞：冠狀動脈粥樣硬化斑塊形成相關(guān)的靶點基因的探索及其功能與機制的研究

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【摘要】：研究背景及目的：冠狀動脈粥樣硬化性心臟病是由多種原因引起的常見疾病,近年其發(fā)病率在不斷上升。冠狀動脈內(nèi)粥樣硬化斑塊的形成及其破裂和血栓形成,是引起急性心血管事件的主要原因。目前除了對肥胖,吸煙,高血壓,糖尿病,高脂血癥等傳統(tǒng)的危險因素的研究外,人們對冠狀動脈粥樣硬化斑塊形成相關(guān)的靶點基因的研究越來越重視。肌細胞增強因子2A(MEF2A)基因是第一個被發(fā)現(xiàn)的引起冠狀動脈性心臟病CHD和心肌梗死MI的致病基因,隨后越來越多的關(guān)于MEF2A基因突變所致的冠狀動脈粥樣硬化性心臟病的研究出現(xiàn)。我們對一有家族性冠心病發(fā)病現(xiàn)象的家庭進行了調(diào)查,發(fā)現(xiàn)該家族患病成員均有MEF2A基因第11外顯子"CAGCCG"六個堿基的缺失。MEF2A基因功能的異常導(dǎo)致了CHD和MI的發(fā)生。炎癥參與動脈粥樣硬化斑塊形成和發(fā)展過程,可誘導(dǎo)分泌多種細胞因子,如TNF-α, IL-6等。巨噬細胞在調(diào)節(jié)動脈粥樣硬化斑塊內(nèi)炎癥方面起著至關(guān)重要的作用。經(jīng)典活化激活的巨噬細胞(M1)促進炎癥的發(fā)展,替代活化激活的巨噬細胞(M2)抑制炎癥發(fā)展。通過調(diào)控巨噬細胞功能可以改善動脈粥樣硬化斑塊的形成和進展。精氨酸酶-1(Arg-1)能促進平滑肌細胞增殖并抑制炎癥,高表達于M2型巨噬細胞,能抑制巨噬細胞炎癥反應(yīng),減少腫瘤壞死因子-α (TNF-α)的生成和單核細胞的趨化遷移,還能減弱動脈粥樣硬化斑塊內(nèi)的炎癥反應(yīng)從而穩(wěn)定斑塊,我們之前的研究已充分證實Arg-1在冠狀動脈粥樣硬化斑塊中的作用。通過對Arg-1上游調(diào)控基因的探索,可以發(fā)現(xiàn)與動脈粥樣硬化相關(guān)的新的調(diào)控基因,通過新基因的探索及對其功能的研究可以找到新的冠心病干預(yù)靶點,對疾病的研究具有重要意義。在上述研究的基礎(chǔ)上,我們提出如下假設(shè)：(1)篩選與精氨酸酶1啟動子活性區(qū)域結(jié)合的轉(zhuǎn)錄因子,以發(fā)現(xiàn)與MEF2A調(diào)控冠狀動脈粥樣硬化斑塊形成類似的新的靶點基因。(2)探討新發(fā)現(xiàn)的靶點基因在動脈粥樣硬化斑塊炎癥反應(yīng)中的作用及機制。本研究基于發(fā)現(xiàn)MEF2A基因功能異常導(dǎo)致家族性冠狀動脈粥樣硬化性心臟病的研究,以之前對Arg-1的研究為基礎(chǔ)。旨在探索調(diào)控斑塊炎癥反應(yīng)的新靶點基因,驗證并明確白細胞介素增強結(jié)合因子3(Interleukin enhancer-binding factor 3, ILF-3)為Arg-1的轉(zhuǎn)錄因子,并對其功能進行研究,以期找到與冠狀動脈粥樣硬化斑塊炎癥相關(guān)的新預(yù)防和治療靶點。方法：1.細胞處理：以脂多糖(LPS)作為炎癥誘導(dǎo)劑,以干擾素γ(IFN-γ)+LPS和白細胞介素4(IL-4)作為巨噬細胞極化分型誘導(dǎo)劑,分別對細胞進行處理。2. pGL3載體的構(gòu)建：應(yīng)用逐段刪除法進行引物設(shè)計,PCR擴增得到-560 bp,-510 bp,-460 bp,-410 bp,-360 bp,-310 bp,-260 bp帶有Arg-1啟動子片斷的Pgl3-basic多克隆載體。3.細胞轉(zhuǎn)染：用Arg1-Pgl3質(zhì)粒轉(zhuǎn)染平滑肌細胞,Arg1-siRNA轉(zhuǎn)染平滑肌細胞,慢病毒轉(zhuǎn)染小鼠細胞系Raw264.7細胞,轉(zhuǎn)染完成后進行下一步實驗或檢測。4.熒光素酶活性的檢測：制備細胞裂解液,按照熒光素酶試劑盒說明書處理并及時用光度計進行檢測,檢測出高熒光素酶活性片段。5.Arg-1-460bp至-410 bp啟動子區(qū)域結(jié)合蛋白的純化和分析鑒定：應(yīng)用DNA結(jié)合蛋白純化試劑盒,純化Arg-1-460 bp至-410 bp啟動子區(qū)域的結(jié)合蛋白,經(jīng)胰蛋白酶消化和脫鹽處理后送公司檢進行蛋白質(zhì)分析檢測,分析活性區(qū)域的結(jié)合蛋白。6.染色質(zhì)免疫共沉淀(Chromatin immunoprecipitation, ChIP):按試劑盒說明書操作,驗證ILF-3是否與Arg-1啟動子的活性片段直接結(jié)合。7.熒光實時定量RT-PCR檢測：提取細胞總RNA,檢測ILF-3, Arg-1及細胞炎性因子mRNA的表達。8. Western blot檢測：提取細胞總蛋白,檢測β-actin, GAPDH, ILF-3, Arg-1, IL-10, TNF-α, IL-6, P38/phospho-P38, JNK/phospho-JNK, ERK/phospho-ERK,核因子-κb(NF-κB)P65的蛋白表達。9.組織免疫化學(xué)分析：對人冠狀動脈粥樣硬化斑塊石蠟切片進行免疫化學(xué)染色,觀察ILF-3在斑塊中的分布。10.免疫熒光實驗分析：用免疫熒光染色及激光共聚焦技術(shù),觀察ILF-3在巨噬細胞中的定位,以及觀察ILF-3和Arg-1在人冠狀動脈和冠脈粥樣硬化斑塊中的定位。研究結(jié)果：1.ILF-3直接結(jié)合于Arg-1啟動子的-460bp到-410bp區(qū)域并調(diào)節(jié)精氨酸酶1轉(zhuǎn)錄過程。經(jīng)液相質(zhì)譜儀分析ILF-3結(jié)合于Arg-1啟動子上,經(jīng)ChIP驗證確定ILF-3可直接結(jié)合于Arg-1啟動子,使用ILF-3小干擾RNA抑制ILF-3的蛋白表達后精氨酸酶1mRNA水平和蛋白質(zhì)水平均下降了70%(p0.01)。2.Raw 264.7細胞中ILF-3和炎性因子在LPS誘導(dǎo)下的時間和劑量依賴性表達。隨著LPS劑量的增加,ILF-3蛋白質(zhì)的表達開始時增加達到峰值然后減少,在1000ng/ml時出現(xiàn)了下降的趨勢。隨著LPS刺激時間的延長,ILF-3表達量在2 h開始增加,在4 h達到頂峰。隨后ILF-3表達開始下降直到第72 h。Arg-1的表達量在2 h增加,12 h達頂峰,IL-10在4 h達到頂峰,之后Arg-1和IL-10都開始下降。3.ILF-3在巨噬細胞和動脈粥樣硬化斑塊中的表達。在Raw 264.7細胞中,ILF-3主要分布在細胞核,特別是核仁。Western blot和激光共焦顯微鏡的結(jié)果表明ILF-3在M1型巨噬細胞低表達,在M2型巨噬細胞中高表達。在動脈粥樣硬化斑塊中,ILF-3在斑塊中高表達并且主要集中在巨噬細胞中,對ILF-3和Arg-1免疫熒光雙標(biāo)顯示ILF-3和Arg-1共同表達于人冠狀動脈粥樣硬化斑塊中,并有共定位現(xiàn)象,兩者都在巨噬細胞高表達。4.過表達ILF-3抑制巨噬細胞中LPS誘導(dǎo)的炎性因子并上調(diào)抗炎細胞因子。LPS誘導(dǎo)增加了TNF-a, IL-6和1L-1p表達水平,過表達ILF-3后TNF-a IL-6和IL-1β明顯減少,而1L-10和Arg-1表達量與LPS組相比增加了。在過表達ILF-3但未用LPS刺激時,PCR和Western blot結(jié)果顯示Arg-1和IL-10表達同樣顯著增加。5.過表達ILF-3抑制絲裂原激活的蛋白激酶(MAPK) 和 NF-κ B信號通路的激活。與未作處理細胞相比,LPS可以增加p-P38, p-JNK, p-ERK,和P65的蛋白表達。ILF-3過表達顯著減弱LPS誘導(dǎo)的P65及磷酸化P38和JNK的表達,但沒有減少p-ERK的表達。結(jié)果表明,ILF-3參與LPS誘導(dǎo)NF-κB和MAPK信號通路調(diào)節(jié)過程。結(jié)論及意義：1. ILF-3為Arg-1的轉(zhuǎn)錄因子,調(diào)控Arg-1的轉(zhuǎn)錄,為冠狀動脈粥樣硬化性斑塊炎癥相關(guān)的新的靶點基因。2. ILF-3高表達于M2型巨噬細胞,能增強M2型巨噬細胞功能。3.ILF-3抑制LPS誘導(dǎo)的巨噬細胞炎性因子的分泌并促進抗炎因子的分泌。4.ILF-3的抑炎作用是通過抑制p-P38/MAPK, p-JNK/MAPK和NF-Kb信號通路來實現(xiàn)的。5.我們篩選出了Arg-1的轉(zhuǎn)錄因子ILF-3,并對ILF-3在冠狀動脈粥樣硬化斑塊以及巨噬細胞中的分布以及細胞炎性因子分泌中的作用和機制進行了系統(tǒng)研究,ILF-3很可能會成為與冠狀動脈粥樣硬化炎癥相關(guān)的新預(yù)防和治療靶點,對冠狀動脈粥樣硬化性心臟病的研究具有重要意義。
【關(guān)鍵詞】：白細胞介素增強結(jié)合因子3 巨噬細胞 細胞因子 核因子-κb 絲裂原激活的蛋白激酶
【學(xué)位授予單位】：山東大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2016
【分類號】：R541.4
【目錄】：

• 中文摘要6-10
• ABSTRACT10-15
• 英文對照縮略表15-17
• 前言17-20
• 材料與方法20-31
• 結(jié)果31-35
• 討論35-39
• 實驗結(jié)論39-40
• 附圖40-51
• 參考文獻51-57
• 文獻綜述57-65
• 參考文獻59-65
• 致謝65-66
• 攻讀學(xué)位期間發(fā)表論文66-67
• 學(xué)位論文評閱及答辯情況表67

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本文編號：696424