本文關(guān)鍵詞：PDGF-BB誘導(dǎo)血管平滑肌細(xì)胞自噬與血管鈣化的關(guān)系及其作用機制

  更多相關(guān)文章： 細(xì)胞自噬 血管鈣化 血管平滑肌細(xì)胞 Beclin1 PI3KC3

【摘要】：目的:研究表明,自噬可能是一種新的自我適應(yīng)機制,通過減少釋放基質(zhì)小泡,自噬可以降低磷酸鹽引起的血管鈣化。此外,阿伐他汀通過抑制β-catenin信號通路引起自噬,從而降低轉(zhuǎn)化生長因子-β(transforming growth factor-β,TGF-β)引起的血管平滑肌細(xì)胞(vascular smooth muscle cell,VSMC)鈣化。血小板源生長因子(platelet-derived growth factor,PDGF-BB)能夠誘導(dǎo)自噬發(fā)生,降解收縮蛋白,調(diào)控VSMCs由收縮型轉(zhuǎn)變?yōu)樵鲋承?增加了氧化應(yīng)激時細(xì)胞的生存能力。然而,PDGF-BB誘導(dǎo)的VSMC自噬與血管鈣化的關(guān)系尚不清楚,因此本實驗利用PDGF-BB刺激VSMCs不同時間,探討VSMC自噬與血管鈣化的相關(guān)性及其作用機制。方法:1 VSMC培養(yǎng)選取80-100 g雄性SD大鼠(清潔級),貼塊法分離胸腹主動脈培養(yǎng)于含10%FBS的DMEM培養(yǎng)基中。待細(xì)胞生長至70-80%匯合后,0.25%胰蛋白酶消化傳代,取3-5代細(xì)胞進行實驗。2 Western blot分析取等量的蛋白進行SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳(PAGE),半干法將分離膠上的蛋白轉(zhuǎn)移到PVDF膜上。以5%的脫脂奶粉37℃封閉2 h。加入一抗4℃過夜,TBST洗膜后以HPR標(biāo)記的Ig G二抗37℃封閉2 h,TBST洗膜后,ECL化學(xué)發(fā)光成像。3免疫熒光染色分析處理后的細(xì)胞用4%多聚甲醛固定15 min,1%Triton X-100處理15min,10%山羊血清室溫封閉30 min后,分別加入兔抗Beclin1多克隆抗體與兔抗LC3多克隆抗體,4℃孵育過夜。經(jīng)PBS充分漂洗后,加入Alexa Fluor 555標(biāo)記的羊抗兔熒光二抗室溫孵育,激光共聚焦顯微鏡下觀察。4免疫共沉淀分析處理后的細(xì)胞溶解于緩沖液(50 mMTris-HCl,pH 7.6,150 m M Na Cl,1%NP-40,10 m M磷酸二氫鈉,10 m M Na F,2 m M PMSF)中,4℃離心后,吸取上清,分別加入Beclin1抗體或PI3KC3抗體,然后加入Protein A agarose 4℃過夜,洗滌后,收集Protein A-抗原-抗體復(fù)合物進行Western blot檢測。結(jié)果:1 PDGF-BB刺激VSMCs不同時間對鈣化標(biāo)志物表達(dá)的影響PDGF-BB(10 ng/mL)刺激VSMCs不同時間(6、12、24、48、72 h),同時設(shè)不含刺激物的陰性對照組。Western blot分析檢測血管鈣化相關(guān)蛋白BMP2與ALP的表達(dá)。結(jié)果顯示,BMP2與ALP的表達(dá)隨刺激時間不同而變化,呈先降低后增高的趨勢,ALP在12 h達(dá)到低谷,BMP2在6 h達(dá)到低谷。2 PDGF-BB刺激VSMCs不同時間對自噬標(biāo)志物表達(dá)的影響PDGF-BB刺激VSMCs不同時間(6、12、24、48、72 h),Western blot分析檢測自噬相關(guān)蛋白Beclin1與LC3的表達(dá),其中LC3-Ⅰ向LC3-Ⅱ轉(zhuǎn)化率增加表明自噬活動增強,它被認(rèn)為是一個可靠的自噬體形成標(biāo)志。結(jié)果顯示,Beclin1的表達(dá)隨刺激時間不同而變化,呈先增高后降低的趨勢,且在12 h達(dá)到高峰。LC3-Ⅰ向LC3-Ⅱ的轉(zhuǎn)化呈時間依賴性增強,并在48 h時達(dá)到高峰,隨后降低。細(xì)胞免疫熒光染色結(jié)果亦顯示,與對照組相比,PDGF-BB刺激12 h后,LC3與Beclin1的表達(dá)均顯著增強。3自噬抑制劑3-MA對PDGF-BB誘導(dǎo)VSMC鈣化的影響3-MA(10 m M)預(yù)孵育VSMCs 2 h后,PDGF-BB刺激12 h,Western blot分析檢測自噬相關(guān)蛋白Beclin1與LC3的表達(dá),結(jié)果顯示,3-MA明顯降低PDGF-BB誘導(dǎo)的Beclin1與LC3的表達(dá)。免疫熒光染色也顯示類似結(jié)果,與PDGF-BB刺激組相比,3-MA/PDGF-BB刺激組的細(xì)胞中Beclin1與LC3的表達(dá)明顯減弱。隨后,觀察3-MA對血管鈣化相關(guān)蛋白BMP2與ALP表達(dá)的影響。Western blot結(jié)果顯示,與PDGF-BB刺激組相比,3-MA預(yù)孵育的PDGF-BB刺激組中BMP2與ALP的表達(dá)明顯增高。4 PDGF-BB對Beclin1與PI3KC3相互作用以及Beclin1磷酸化的影響PDGF-BB刺激VSMCs不同時間(0、6、12、24 h),細(xì)胞裂解液分別用Beclin1抗體與PI3KC3抗體進行交互免疫共沉淀分析,結(jié)果顯示,隨著刺激時間的延長,Beclin1與PI3KC3的相互作用逐漸增強,12 h達(dá)到高峰,24 h仍維持較高水平。然后,細(xì)胞裂解液用抗p-Ser抗體進行免疫沉淀后,用抗Beclin1抗體檢測磷酸化的Beclin1水平,結(jié)果顯示,PDGF-BB處理VSMCs后,Beclin1磷酸化水平增高,6 h達(dá)到高峰,12 h仍維持較高水平。結(jié)論:1 PDGF-BB刺激早期抑制VSMC鈣化,晚期促進VSMC鈣化。2 PDGF-BB誘導(dǎo)的VSMC自噬被3-MA抑制后,VSMC鈣化加劇。3 PDGF-BB通過誘導(dǎo)Beclin1磷酸化以及PI3KC3與Beclin1相互作用,促進VSMC自噬。
【關(guān)鍵詞】：細(xì)胞自噬 血管鈣化 血管平滑肌細(xì)胞 Beclin1 PI3KC3
【學(xué)位授予單位】：河北醫(yī)科大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2016
【分類號】：R54
【目錄】：

• 中文摘要4-7
• 英文摘要7-10
• 英文縮寫10-11
• 前言11-13
• 材料與方法13-17
• 結(jié)果17-19
• 附圖19-27
• 討論27-29
• 結(jié)論29-30
• 參考文獻(xiàn)30-34
• 綜述 自噬與動脈粥樣硬化關(guān)系的研究進展34-47
• 參考文獻(xiàn)41-47
• 致謝47-48
• 個人簡歷48

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本文編號：640996