本文關(guān)鍵詞：吲哚胺2,3雙加氧酶調(diào)節(jié)血管平滑肌細(xì)胞表型轉(zhuǎn)換的體外研究

  更多相關(guān)文章： 低色氨酸 犬尿氨酸 吲哚氨2 3雙加氧酶 血管平滑肌細(xì)胞 增值表型轉(zhuǎn)換

【摘要】：目的：為探索吲哚胺2,3雙加氧酶(indoleamine 2,3-dioxygenase, IDO)及其代謝微環(huán)境(低色氨酸及色氨酸代謝產(chǎn)物堆積)在動脈硬化閉塞癥(atherosclerotic occlusive, ASO)、經(jīng)皮動脈腔內(nèi)血管成形術(shù)(percutaneous transluminal angioplasty, PTA)及支架植入術(shù)后再狹窄(restenosis, RS)等病理過程中的作用,本實驗研究其體外對血管平滑肌細(xì)胞(Vascular Smooth Muscular Cell, VSMC)增殖及表型轉(zhuǎn)換的影響。方法：采用血管環(huán)翻轉(zhuǎn)貼壁法原代培養(yǎng)小鼠主動脈平滑肌細(xì)胞(SMCs),并對其進(jìn)行平滑肌α-肌動蛋白(SM α-actin)免疫細(xì)胞化學(xué)法(immunocyto-chemistry, ICC)鑒定；應(yīng)用低色氨酸(Low-tryptophan, L-Trp)及其代謝產(chǎn)物犬尿氨酸(Kynurenine, KYN)培養(yǎng)并觀察對其增殖能力及表型基因表達(dá)的影響；通過與高表達(dá)IDO的小鼠血管瘤內(nèi)皮細(xì)胞(EOMA, ATCC(?) CRL-2586TM)聯(lián)合培養(yǎng),利用MTT法檢測其增殖情況,并應(yīng)用實時熒光定量聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(quantified real time PCR, qRT-PCR)檢測其表型基因的表達(dá)水平上的差異。使用SPSS 19.0軟件包進(jìn)行數(shù)據(jù)分析。結(jié)果：經(jīng)上述方法體外培養(yǎng)主動脈SMCs,5-10天可有細(xì)胞萌出,每取材2只小鼠可獲得約6×105個二代SMCs,傳至第三代時細(xì)胞生長呈典型的“峰”和“谷”形態(tài),經(jīng)SM α-actin免疫組化鑒定呈陽性(棕色),細(xì)胞純度達(dá)95%以上。3-10代細(xì)胞增殖旺盛,形態(tài)典型,細(xì)胞傳代至10-12代以后細(xì)胞形態(tài)變化較大,生長緩慢,凋亡增多。取3-5代SMCs用于后續(xù)實驗。L-Trp可以較為明顯抑制SMCs的增殖,但其代謝產(chǎn)物KYN則只有在高濃度下才會對SMCs的增殖產(chǎn)生抑制作用,而且這種抑制作用在培養(yǎng)96小時后才會表現(xiàn)出來,qRT-PCR顯示：在120小時的培養(yǎng)時間內(nèi),無論是L-Trp還是KYN培養(yǎng)均未對SMCs收縮表型基因Smoothelin-B的表達(dá)產(chǎn)生顯著影響,單純KYN (200 μM)培養(yǎng)對合成表型基因Syndecan-1的表達(dá)亦未產(chǎn)生明顯影響,而只有L-Trp (10μM)及L-Trp+KYN聯(lián)合培養(yǎng)組在培養(yǎng)72h、96h、120h時Syndecan-1的表達(dá)顯著下調(diào)�？紤]可能是單純色氨酸饑餓環(huán)境產(chǎn)生的影響,而代謝產(chǎn)物KYN (200 μM)并不能顯著影響此兩種表型基因的表達(dá)。SMCs與高表達(dá)小鼠IDO的EOMA共培養(yǎng)后96h、120h后,SMCs的增殖受到抑制,而添加IDO特異性抑制劑1-mT(1-methyl tryptophan,1-甲基色氨酸)后這種抑制作用消失,提示IDO對SMCs的增殖產(chǎn)生抑制作用。qRT-PCR結(jié)果提示平滑肌細(xì)胞Smoothelin-B在與EOMAIDO+共培養(yǎng)96h、120h后表達(dá)顯著上調(diào),Syndecan-1則在共培養(yǎng)120h后表達(dá)下調(diào),添加1-mT后這種效應(yīng)被削弱。結(jié)論：采用改良的血管環(huán)翻轉(zhuǎn)貼壁法能獲得高純度的SMCs,簡單易行,且有效避免了外膜成纖維細(xì)胞及內(nèi)膜內(nèi)皮細(xì)胞的污染�？蔀閷嶒炑芯刻峁┘�(xì)胞材料。低色氨酸(10μM)可抑制平滑肌細(xì)胞的增殖,而其代謝產(chǎn)物KYN只有在高濃度(200μ M)下才產(chǎn)生這種抑制作用,不認(rèn)為兩者對SMCs的表型轉(zhuǎn)換有明顯影響。IDO可抑制SMCs的增殖及去分化,促進(jìn)SMCs向收縮型轉(zhuǎn)換,尚不能認(rèn)為這種效應(yīng)由色氨酸饑餓及其代謝產(chǎn)物聚集所引起,可能存在其他作用機制尚待研究。
【關(guān)鍵詞】：低色氨酸 犬尿氨酸 吲哚氨2 3雙加氧酶 血管平滑肌細(xì)胞 增值表型轉(zhuǎn)換
【學(xué)位授予單位】：天津醫(yī)科大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2015
【分類號】：R543.5
【目錄】：

• 中文摘要4-6
• Abstract6-10
• 符號說明10-11
• 前言11-15
• 研究現(xiàn)狀、成果11-12
• 研究目的、方法12-14
• 實驗流程圖14-15
• 一、原代培養(yǎng)小鼠主動脈平滑肌細(xì)胞15-26
• 1.1 實驗對象和方法15-19
• 1.1.1 實驗動物15
• 1.1.2 主要試驗儀器15
• 1.1.3 主要試劑15-16
• 1.1.4 原代培養(yǎng)小鼠血管平滑肌細(xì)胞16-17
• 1.1.5 細(xì)胞消化傳代及純化17
• 1.1.6 免疫組化鑒定及細(xì)胞純度17-18
• 1.1.7 細(xì)胞計數(shù)及活力檢測18
• 1.1.8 細(xì)胞凍存與復(fù)蘇18-19
• 1.1.9 生長曲線19
• 1.2 結(jié)果19-20
• 1.2.1 細(xì)胞形態(tài)學(xué)觀察19-20
• 1.2.2 傳代及活力20
• 1.2.3 生長曲線20
• 1.2.4 免疫組化20
• 1.3 討論20-22
• 1.4 小結(jié)22-23
• 附圖23-26
• 二、體外IDO對平滑肌細(xì)胞增殖及表型轉(zhuǎn)換的影響26-47
• 2.1 對象和方法26-39
• 2.1.1 實驗材料與儀器26-27
• 2.1.2 L-TRP及其代謝產(chǎn)物KYN培養(yǎng)SMCs27-28
• 2.1.3 高表達(dá)IDO的EOMA對SMCs的影響28-33
• 2.1.4 MTT檢測SMCs增殖33
• 2.1.5 qRT-PCR檢測其表型基因表達(dá)33-38
• 2.1.6 統(tǒng)計學(xué)分析數(shù)據(jù)38-39
• 2.2 結(jié)果39-44
• 2.2.1 MTT檢測VSMC增殖情況39-40
• 2.2.2 qRT-PCR檢測其表型基因表達(dá)40-44
• 2.3 討論44-46
• 2.4 小結(jié)46-47
• 結(jié)論47-48
• 參考文獻(xiàn)48-51
• 發(fā)表論文和參加科研情況說明51-52
• 附錄52-59
• 綜述59-73
• 參考文獻(xiàn)68-73
• 致謝73

【共引文獻(xiàn)】

中國期刊全文數(shù)據(jù)庫 前2條

1 李永光;朱偉;陸志剛;魏盟;;STAT3在血管平滑肌細(xì)胞中的作用及其機制的最新進(jìn)展[J];上海醫(yī)學(xué);2014年07期

2 韓博;徐三榮;張進(jìn);周慶;李偉;;同基因與異基因胚胎肝干細(xì)胞移植治療小鼠肝硬化[J];中國組織工程研究;2013年36期

中國博士學(xué)位論文全文數(shù)據(jù)庫 前1條

1 張沛;SOCS3在心臟移植慢性排斥反應(yīng)中的作用和機制研究[D];華中科技大學(xué);2014年

中國碩士學(xué)位論文全文數(shù)據(jù)庫 前3條

1 邱梅紅;肺動脈高壓大鼠心室間糖酵解代謝相關(guān)基因篩選和差異[D];吉林大學(xué);2014年

2 呂慧彥;外周血中S100A4蛋白水平與肺腺癌、肺鱗癌的相關(guān)性分析[D];大連醫(yī)科大學(xué);2014年

3 朱麗娟;食管鱗狀細(xì)胞癌組織中S100A11、14-3-3、Gstp和HnRNPA2/B1的表達(dá)及其臨床意義的研究[D];新疆醫(yī)科大學(xué);2014年

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本文編號：639724