本文關(guān)鍵詞：人臍帶血間充質(zhì)干細(xì)胞分離培養(yǎng)及誘導(dǎo)表達(dá)IDO對(duì)免疫介導(dǎo)再生障礙性貧血小鼠的治療研究

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【摘要】：第一部分人臍血間充質(zhì)干細(xì)胞的分離培養(yǎng)及其生物學(xué)特性研究 目的：從人的臍帶血中分離和培養(yǎng)臍帶血間充質(zhì)干細(xì)胞（umbilical cordblood-mesenchymal stem cells, UCB-MSCs），探討其培養(yǎng)條件、表面標(biāo)志表達(dá)以及體外多向分化潛能等生物學(xué)特性。 方法：1.建立分離培養(yǎng)方法：淋巴細(xì)胞分離法與羥乙基淀粉沉降+淋巴細(xì)胞分離兩步法進(jìn)行比較；2.細(xì)胞生長(zhǎng)及增殖能力觀察；3.免疫表型測(cè)定；4.誘導(dǎo)多向分化潛能：選取P3~P5UCB-MSCs，經(jīng)成骨、成脂誘導(dǎo)分化，分別用茜素紅、油紅O染色鑒定。 結(jié)果：通過(guò)羥乙基淀粉沉降+淋巴細(xì)胞分離兩步法分離得到的臍帶血單個(gè)核細(xì)胞數(shù)量較淋巴細(xì)胞分離法明顯增多，，UCB-MSCs為成纖維樣細(xì)胞貼壁生長(zhǎng)，原代培養(yǎng)3-4周呈現(xiàn)平行或漩渦樣生長(zhǎng)；流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)結(jié)果表明，UCB-MSCs表達(dá)黏附分子CD44表面標(biāo)志及干細(xì)胞特征標(biāo)志CD73，不表達(dá)造血分子CD34，具有MSCs特征；體外誘導(dǎo)成骨、脂肪細(xì)胞分化成功，表明其具有分化潛能。 結(jié)論：UCB-MSCs在體外成功分離與培養(yǎng)，具有間充質(zhì)干細(xì)胞生物學(xué)特性。 第二部分IFN-γ誘導(dǎo)臍血間充質(zhì)干細(xì)胞IDO表達(dá)及對(duì)異基因淋巴細(xì)胞增殖的影響 目的：探討不同濃度的γ-干擾素（IFN-γ）作用于UCB-MSCs，誘導(dǎo)其表達(dá)吲哚胺2，3-雙加氧酶（IDO）的情況；觀察UCB-MSCs上的IDO表達(dá)對(duì)異基因淋巴細(xì)胞增殖的影響。 方法：選取P3~P5UCB-MSCs，經(jīng)不同濃度IFN-γ(0、50、100、200、400U/ml)誘導(dǎo)刺激24h，提取細(xì)胞mRNA和蛋白，分別采用RT-PCR法和Western blot檢測(cè)IDO表達(dá)情況。在有/無(wú)IDO特異性抑制劑1-甲基色氨酸（1-MT）的情況下，設(shè)定UCB-MSCs不同濃度組，絲裂霉素C處理，與異基因淋巴細(xì)胞共培養(yǎng)，MTT法檢測(cè)淋巴細(xì)胞增殖率。 結(jié)果：UCB-MSCs本身不具有IDO的表達(dá)，經(jīng)IFN-γ刺激作用下出現(xiàn)IDOmRNA、 IDO蛋白表達(dá)，且表達(dá)量與IFN-γ的刺激濃度呈劑量依賴關(guān)系。UCB-MSCs：淋巴細(xì)胞比值為1：1，1：10，1：50時(shí)，與對(duì)照組比較，淋巴細(xì)胞增殖率均顯著降低（P0.05），且隨UCB-MSCs濃度減小，對(duì)淋巴細(xì)胞增殖的抑制率減低。當(dāng)UCB-MSCs：淋巴細(xì)胞比值為1：100時(shí)，淋巴細(xì)胞增殖率與對(duì)照組相比無(wú)明顯差別（P0.05）。在加入1-甲基色氨酸（1-MT）的共培養(yǎng)體系中，UCB-MSCs對(duì)T細(xì)胞增殖的抑制作用恢復(fù)。 結(jié)論：UCB-MSCs在IFN-γ的誘導(dǎo)作用下可表達(dá)IDO，對(duì)異基因淋巴細(xì)胞的增殖可能發(fā)揮免疫抑制作用。 第三部分人臍血間充質(zhì)干細(xì)胞的IDO表達(dá)對(duì)免疫介導(dǎo)再生障礙性貧血小鼠治療作用的研究 目的：建立免疫介導(dǎo)再障小鼠模型，探討人臍帶血間充質(zhì)干細(xì)胞的IDO表達(dá)對(duì)再障小鼠的治療影響及其發(fā)揮免疫抑制作用的機(jī)制。方法：采用SPF級(jí)6～14周齡雌性DBA/2小鼠為供鼠，經(jīng)5.5Gy60Co-γ射線全身照射的8～12周齡雌性BALB/C小鼠為受鼠，移植供鼠胸腺/淋巴結(jié)細(xì)胞，建立免疫介導(dǎo)再障模型；建模穩(wěn)定后，經(jīng)小鼠尾靜脈輸注UCB-MSCs（1×103/g），觀察各組小鼠外周血象、骨髓病理形態(tài)以及造血負(fù)調(diào)控因子INF-γ水平的變化。 結(jié)果：再障模型建立后7~16d，AA小鼠出現(xiàn)皮毛散亂、食欲下降，體重減輕22.58±15.74%，蒼白萎頓；第14d模型組外周血象、骨髓造血明顯降低，經(jīng)尾靜脈輸注MSCs進(jìn)行觀察，2周時(shí)血象指標(biāo)回升，與模型組相比差異顯著。MSCs的IDO的表達(dá)對(duì)再障小鼠各血象指標(biāo)的變化效果明顯，同時(shí)骨髓造血情況也有明顯改善。 結(jié)論：具有表達(dá)IDO的UCB-MSCs輸注再生障礙性貧血小鼠模型，可減輕小鼠骨髓造血衰竭程度。
【關(guān)鍵詞】：臍帶血 間充質(zhì)干細(xì)胞 分離 培養(yǎng) 生物學(xué)特性 臍帶血間充質(zhì)干細(xì)胞 IFN-γ IDO 異基因 淋巴細(xì)胞 臍帶血間充質(zhì)干細(xì)胞 免疫介導(dǎo) 再生障礙性貧血 IDO 治療
【學(xué)位授予單位】：蚌埠醫(yī)學(xué)院
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2012
【分類號(hào)】：R556
【目錄】：

• 中文摘要5-7
• Abstract7-10
• 前言10-12
• 第一部分 人臍血間充質(zhì)干細(xì)胞的分離培養(yǎng)及其生物學(xué)特性研究12-23
• 引言12
• 主要材料與儀器12-14
• 實(shí)驗(yàn)方法14-15
• 實(shí)驗(yàn)結(jié)果15-18
• 討論18-19
• 參考文獻(xiàn)19-23
• 第二部分 IFN-γ誘導(dǎo)臍血間充質(zhì)干細(xì)胞 IDO 表達(dá)及對(duì)異基因淋巴細(xì)胞增殖的影響23-37
• 引言23
• 主要材料與儀器23-24
• 實(shí)驗(yàn)方法24-30
• 實(shí)驗(yàn)結(jié)果30-32
• 討論32-35
• 參考文獻(xiàn)35-37
• 第三部分 人臍血間充質(zhì)干細(xì)胞的 IDO 表達(dá)對(duì)免疫介導(dǎo)再生障礙性貧血小鼠治療作用的研究37-47
• 引言37
• 主要材料與儀器37-38
• 實(shí)驗(yàn)方法38-40
• 實(shí)驗(yàn)結(jié)果40-43
• 討論43-44
• 展望44-45
• 參考文獻(xiàn)45-47
• 結(jié)論47-48
• 致謝48-49
• 附錄 A 主要英文縮略詞49-50
• 附錄 B 常用試劑配制50-51
• 附錄 C 個(gè)人簡(jiǎn)介及攻讀學(xué)位期間公開(kāi)發(fā)表的論文51-52
• 附錄 D 綜述 IDO 與再生障礙性貧血的免疫介導(dǎo)52-58
• 參考文獻(xiàn)56-58

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本文編號(hào)：621697