本文關(guān)鍵詞：LKB1-AMPK-mTOR通路在oxLp（a）誘導(dǎo)HUVECs自噬中的作用研究

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【摘要】：【研究背景】 高Lp(a)被認(rèn)為是As的獨(dú)立危險(xiǎn)因子，Lp(a)被證實(shí)比LDL更易被氧化，形成為其氧化產(chǎn)物oxLp(a)，與天然的Lp(a)相比，oxLp(a)被認(rèn)為更具致動(dòng)脈粥樣硬化(As)作用潛質(zhì)。臨床研究表明， oxLp(a)更易在動(dòng)脈內(nèi)膜處積累，并與動(dòng)脈內(nèi)膜增厚病癥成顯著相關(guān)性。自噬被認(rèn)為是As病理過程中發(fā)揮重要作用的細(xì)胞應(yīng)激反應(yīng)。有研究顯示oxLDL可以引起HUVECs的自噬發(fā)生，從而降解細(xì)胞攝取的氧化脂質(zhì)，但具體機(jī)制尚不清楚。本課題組前期工作證實(shí)oxLp(a)可引起HUVECs內(nèi)的活性氧的生成量的增加，而活性氧可以引起細(xì)胞發(fā)生氧化應(yīng)激進(jìn)而激活自噬通路LKB1-AMPK-mTOR誘導(dǎo)細(xì)胞發(fā)生自噬已是公認(rèn)的事實(shí)。因此，本研究推測oxLp(a)可以通過被細(xì)胞攝取到細(xì)胞內(nèi)，使細(xì)胞內(nèi)活性氧的生成量增加，通過活性氧激活A(yù)MPK-mTOR信號(hào)通路誘導(dǎo)細(xì)胞發(fā)生自噬，以降解被攝取的oxLp(a)以及分解在oxLp(a)所產(chǎn)生的氧化環(huán)境下細(xì)胞內(nèi)被氧化的蛋白，進(jìn)而發(fā)揮自噬對HUVECs產(chǎn)生保護(hù)作用。 【方法】 首先分析oxLp(a)誘發(fā)HUVECs自噬的發(fā)生。用不同的濃度梯度氧化Lp(a)作用HUVECs不同時(shí)間，蛋白印跡法檢測自噬標(biāo)志蛋白LC3和beclin1的表達(dá)情況，RT-PCR檢測自噬基因beclin1的mRNA的表達(dá)水平。自噬抑制劑3MA和CQ與oxLp(a)共孵育下，以及細(xì)胞形態(tài)學(xué)LC3細(xì)胞免疫熒光和MDC自噬泡染色方法檢測自噬標(biāo)志物的表達(dá)情況，系統(tǒng)分析oxLp(a誘導(dǎo)HUVECs自噬的發(fā)生。其次，DCFH-DA法檢測oxLp(a)誘導(dǎo)的細(xì)胞活性氧的產(chǎn)生。Western blot法檢測NAC對oxLp(a)誘導(dǎo)的自噬蛋白LC3和beclin1的含量。第三，在細(xì)胞用不同時(shí)間的相同濃度的oxLp(a)處理下，加入PARP-1特意抑制劑3AB，AMPK抑制劑Comp C與oxLp(a)共孵育HUVECs，Western blot檢測信號(hào)通路關(guān)鍵蛋白PAR，LC3表達(dá)、AMPK、p70S6K和4EBP1的磷酸化水平。細(xì)胞免疫熒光檢測自噬蛋白MAP1-LC3表達(dá)量，MDC染色法檢測自噬泡的數(shù)量。 【結(jié)果】 1、oxLp(a)濃度和時(shí)間依賴性上調(diào)自噬標(biāo)志蛋白LC3和beclin1的表達(dá)，oxLp(a)濃度依次從低至高為0，25，50,100,200μg/ml，處理HUVECs6h，提取細(xì)胞總蛋白，自噬蛋白LC3和beclin1表達(dá)均隨oxLp(a)濃度的升高而增加，并在100μg/ml處達(dá)到峰值；而在100μg/ml的oxLp(a)分別處理HUVECs不同時(shí)間時(shí)，分別在0h，1.5h，3h，6h和12h時(shí)提取細(xì)胞蛋白，Western blot檢測到自噬蛋白LC3和beclin1均隨時(shí)間增加而上調(diào)并且在6h時(shí)呈現(xiàn)一個(gè)峰值；而自噬抑制劑3MA和CQ與100μg/ml的oxLp(a)共孵育6h下，LC3細(xì)胞免疫熒光和MDC染色法可以檢測出自噬水平的顯著下調(diào)，提示oxLp(a)可以誘導(dǎo)HUVECs發(fā)生自噬。 2、oxLp(a)可以增加HUVECs內(nèi)活性氧的生成量，并以濃度和時(shí)間依賴式上調(diào)胞內(nèi)活性氧的水平，以H2O2作為胞內(nèi)ROS的的陽性對照，并且活性氧清除劑NAC與oxLp(a)共孵育細(xì)胞6h下，細(xì)胞ROS生成量明顯下降。與并且NAC可以有效緩解oxLp(a)誘導(dǎo)的HUVECs的自噬，，與oxLp(a)共處理HUVECs，自噬蛋白LC3表達(dá)量與oxLp(a)組相比明顯下降，提示oxLp(a)可以增加HUVECs ROS的水平，并且ROS參與了oxLp(a)誘導(dǎo)的細(xì)胞自噬。 3、oxLp(a)處理HUVECs，與空白組比較，Western blot檢測結(jié)果顯示自噬信號(hào)相關(guān)通路蛋白PARP-1、自噬蛋白LC3表達(dá)顯著上調(diào)，而PARP-1的特異性抑制劑3AB的加入與oxLp(a)共同處理HUVECs，PAR和LC3的蛋白水平含量明顯下降，同時(shí)，MAP1-LC3細(xì)胞免疫熒光檢測LC3含量降低，而MDC染色法檢測自噬泡的數(shù)量顯著減少。另外，oxLp(a)處理HUVECs可明顯增加AMPK的磷酸化作用，同時(shí)mTOR下游兩個(gè)蛋白p70S6K和4EBP1的磷酸化水平明顯下降。AMPK的特意抑制劑Comp C與oxLp(a)共同處理HUVECs，AMPK的磷酸化水平以及LC的蛋白表達(dá)明顯下調(diào)，而mTOR下游的兩個(gè)蛋白p70S6K和4EBP1的磷酸化水平與對照組相比顯著上調(diào)。證明oxLp(a)通過激活LKB1-AMPK-mTOR信號(hào)通路，誘導(dǎo)HUVECs自噬的發(fā)生。 【結(jié)論】 1、oxLp(a)可誘導(dǎo)HUVECs自噬，并濃度和時(shí)間依賴性上調(diào)LC3和beclin1表達(dá)； 2、oxLp(a)促進(jìn)HUVECs ROS生成，ROS參與了oxLp(a)誘導(dǎo)HUVECs自噬； 3、oxLp(a)通過ROS介導(dǎo)LKB1-AMPK-mTOR通路誘導(dǎo)HUVECs自噬。
【關(guān)鍵詞】：oxLp(a) HUVECs 自噬 活性氧 LKB1-AMPK
【學(xué)位授予單位】：南華大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2013
【分類號(hào)】：R543.5
【目錄】：

• 縮略語4-5
• 摘要5-8
• ABSTRACT8-11
• 前言11-14
• 實(shí)驗(yàn)材料和儀器14-15
• 實(shí)驗(yàn)方法15-18
• 結(jié)果18-28
• 3.1 oxLp(a)誘導(dǎo) HUVECs 自噬發(fā)生18-22
• 3.2 oxLp(a)誘導(dǎo) HUVECs 產(chǎn)生 ROS22-24
• 3.3 PARP-1 參與了 oxLp(a)誘導(dǎo) HUVECs 自噬過程24-26
• 3.4 AMPK 的活化參與了 oxLp(a) 誘導(dǎo) HUVECs 自噬26-28
• 討論28-32
• 結(jié)論32-33
• 參考文獻(xiàn)33-38
• 綜述38-46
• 參考文獻(xiàn)43-46
• 碩士期間發(fā)表的論文46-47
• 致謝47-48
• 基金資助48

【共引文獻(xiàn)】

中國期刊全文數(shù)據(jù)庫 前7條

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中國碩士學(xué)位論文全文數(shù)據(jù)庫 前4條

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3 歐陽芡;IGF-1和運(yùn)動(dòng)對大鼠骨骼肌4E-BP1蛋白表達(dá)和磷酸化影響[D];北京體育大學(xué);2010年

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本文編號(hào)：580156