發(fā)布時間：2017-07-20 15:19

  本文關(guān)鍵詞：Calpains在心肌細(xì)胞生長中的作用

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【摘要】：【背景】心力衰竭是心血管疾病(cardiovascular disease,CVD)的重要死亡原因之一。由心臟壓力超負(fù)荷引起的心肌代償性肥大并向心力衰竭轉(zhuǎn)化,嚴(yán)重制約著CVD的防治效果,但其轉(zhuǎn)化機(jī)制至今仍未完全闡明。探尋壓力超負(fù)荷下,肌原纖維橫向加入的詳細(xì)過程,有助于理解肥厚心肌向心力衰竭轉(zhuǎn)化的機(jī)制。已有研究表明心肌細(xì)胞連接結(jié)構(gòu)閏盤在這一過程中起著重要作用,過渡連接和編織假說的提出較好地解釋了新生肌節(jié)的縱向加入,但肌原纖維橫向加入機(jī)制迄今仍未闡明。肌原纖維組成蛋白處于不斷合成組裝和降解的動態(tài)平衡之中,這兩方面都可被增加的心臟工作負(fù)荷所激活。Calpains是一類鈣依賴性的中性蛋白水解酶,calpastatin是其特異性內(nèi)源性抑制劑,calpains參與了肌原纖維蛋白的降解更新及其細(xì)胞骨架的重塑,且在心肌細(xì)胞肥大時表達(dá)水平增加,推測其在心肌細(xì)胞生長性肥大中亦起著重要作用。在大鼠的生長發(fā)育過程中,隨著心臟容積和壓力負(fù)荷的增加,心肌細(xì)胞不斷增長增寬,本實(shí)驗(yàn)以大鼠出生后的生長發(fā)育過程為模型,探尋建立肌原纖維橫向加入模型以及calpain系統(tǒng)在其中的作用�！灸康摹恳孕律笫鬄檠芯繉ο�,觀測出生后心臟生長發(fā)育過程中,肌原纖維和閏盤結(jié)構(gòu)之間的關(guān)系,建立肌原纖維橫向加入模型,同時探尋calpains系統(tǒng)心肌閏盤重塑及肌節(jié)生長中的可能作用�！痉椒ā吭诖笫蟪錾蟮�1、2、3、4、5、6、7、9、11、14、28、90天,稱量大鼠體重及心重。采用免疫組化方法,以Ki67標(biāo)記增殖細(xì)胞核,麥胚凝集素鑒別細(xì)胞核來源,計算各觀測點(diǎn)心肌細(xì)胞增殖率,確定大鼠出生后心肌快速生長的觀測時間范圍。然后采用透射電鏡定性與定量觀測心肌組織超微結(jié)構(gòu),構(gòu)建肌原纖維從閏盤處橫向加入模型。在此基礎(chǔ)上,利用Western blot技術(shù)、免疫組織化學(xué)熒光技術(shù)與免疫金標(biāo)電鏡技術(shù),檢測心肌閏盤黏著連接跨膜蛋白N-cadherin(N-cad)和縫隙連接跨膜蛋白connexin 43(CX43),以及calpain-1、calpain-2和calpastatin蛋白表達(dá)水平的動態(tài)變化,同時觀測并確認(rèn)calpain-2與calpastatin在閏盤處的定位,分析N-cad、Desmoglein-2(DSG-2,橋粒跨膜蛋白之一)和CX43的共定位關(guān)系與遷移規(guī)律,calpain-2與calpastatin在閏盤重塑過程中的作用。【結(jié)果】1建立肌原纖維在閏盤處橫向加入而使心肌細(xì)胞增寬的模型Ki67蛋白標(biāo)記檢測結(jié)果表明:在大鼠出生后第7天,心肌細(xì)胞增殖速率降至較低水平(6.76%±1.14%),結(jié)合大鼠心重與體重數(shù)據(jù),我們確立觀察時間點(diǎn)為大鼠出生后第7至90天,其中大鼠出生的第7到28天為心臟的快速生長期,第90天作為心臟相對生長成熟的對照點(diǎn)。肌原纖維的寬度分布及其定量分析表明,存在著基本(最小)寬度單位的肌原纖維,我們稱之為初級肌原纖維。心肌細(xì)胞中的初級肌原纖維大部分分布于細(xì)胞膜下;統(tǒng)計分析表明,出生后第7天位于心肌細(xì)胞膜下的初級肌原纖維百分比為48.53%±0.93%,第14天為49.69%±2.51%,第28天為36.84%±0.27%,至出生后第90天,其百分比迅速降低至4.86%±0.12%。這提示心肌細(xì)胞膜下的初級肌原纖維可能為新生的肌原纖維。另一方面,在各個觀測時間點(diǎn)心肌細(xì)胞超微結(jié)構(gòu)上,均可見初級肌原纖維融合為成熟肌原纖維的現(xiàn)象。在大鼠出生后的第7到90天,在相鄰兩個心肌細(xì)胞的Z盤處,可見與心肌細(xì)胞縱軸平行的閏盤,形態(tài)與橋粒類似,缺乏肌絲附著,稱之為平行閏盤。還可見有初級肌原纖維附著的斜行閏盤,以及垂直于心肌細(xì)胞縱軸,形成一個褶皺且與初級肌原纖維連接的初級橫行閏盤。另外則是在成熟心肌細(xì)胞上常見的閏盤,即成熟橫行閏盤,這種閏盤形成數(shù)個波浪狀結(jié)構(gòu),大約0.2~0.5mm寬,成熟肌原纖維與之相連接;亦可見到波浪的峰谷距離增寬至2.0mm的成熟閏盤。定量分析表明:閏盤波浪數(shù)目與肌原纖維寬度呈正線性相關(guān)。大鼠出生后第7至90天,心肌細(xì)胞平行閏盤百分比逐漸降低(第7天為30.81%±0.29%,第14天為18.03%±0.52%,第28天為14.99%±0.33%,第90天為6.14%±0.38%),初級與成熟橫行閏盤百分比逐漸升高(第7天為28.45%±1.20%,第14天為42.50%±0.69%,第28天為45.52%±0.89%,第90天為76.66%±0.71%);在第7到28天,斜行閏盤百分比基本保持不變(第7天為40.75%±1.02%,第14天為39.47%±0.91%,第28天為38.49%±0.57%),到第90天呈顯著性降低(17.20%±0.33%)。這些數(shù)據(jù)提示,閏盤的發(fā)育成熟過程可能是平行閏盤轉(zhuǎn)變成斜行閏盤,斜行閏盤進(jìn)一步轉(zhuǎn)變成初級橫行閏盤,最后形成成熟橫行閏盤。基于上述肌原纖維與閏盤同步生長的實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù),我們提出肌原纖維在閏盤處橫向加入,使心肌細(xì)胞寬度增加的新模型:即在心肌細(xì)胞生長時,鄰近兩個心肌細(xì)胞的Z盤或過渡連接(transitional junction)處生成平行閏盤,隨著附著初級肌原纖維,在縱軸向應(yīng)力作用下,平行閏盤轉(zhuǎn)變?yōu)樾毙伍c盤,接著,心肌細(xì)胞端-端兩側(cè)肌原纖維的對稱生成,使閏盤形成一個褶皺,成為初級橫行閏盤,依此模式不斷橫向增加初級橫行閏盤,伴隨著初級肌原纖維的融合,逐步形成成熟的肌原纖維與閏盤。2心肌發(fā)育過程中,閏盤跨膜結(jié)構(gòu)蛋白的動態(tài)變化特征在心肌生長發(fā)育過程中,N-cad的表達(dá)水平逐漸增加;CX43表達(dá)水平先逐漸增高,至第14天達(dá)峰值,然后逐步降低至一個穩(wěn)定水平。出生后第1天,N-cad、DSG-2與CX43在細(xì)胞膜呈彌散分布;第7天時N-cad與DSG-2在心肌細(xì)胞長軸兩端集聚,CX43亦有少量集聚,標(biāo)示閏盤形成。從第14天到90天,三種蛋白在閏盤處集聚逐步增多;而在側(cè)面的分布表現(xiàn)出一種相反的趨勢:N-cad與DSG-2在細(xì)胞側(cè)面的分布大幅減少,CX43雖在細(xì)胞側(cè)面的分布降低,但至90天仍有CX43分布于細(xì)胞側(cè)面。采用體視學(xué)方法進(jìn)行定量分析表明,在出生第1天,N-cad與DSG-2總的共定位為33.5%;第7天總共定位升高為38.6%,其中閏盤處共定位占9.4%,細(xì)胞側(cè)面共定位為29.2%。從第14天到90天,隨著N-cad與DSG-2總共定位增加至65.7%,在閏盤處的共定位亦增加到60.5%,在細(xì)胞側(cè)面的共定位卻降低至5.2%。N-cad與CX43的總共定位從第1天的10.3%,逐步增加到第90天的37.1%;在閏盤處的共定位逐步增加,而細(xì)胞側(cè)面的共定位保持在5%左右。DSG-2與CX43共定位特征及百分比類似于N-cad與CX43。N-cad與DSG-2共定位百分比明顯高于N-cad與CX43或DSG-2與CX43的共定位。上述結(jié)果提示,大鼠在出生后的心肌發(fā)育過程中,構(gòu)成細(xì)胞力學(xué)連接的N-cad與DSG-2先于構(gòu)成細(xì)胞電化學(xué)連接的CX43在閏盤處集聚,即心肌細(xì)胞生長需形成穩(wěn)定的力學(xué)環(huán)境。這些結(jié)果從另一角度印證了上述肌原纖維橫向加入模型,即先形成力學(xué)結(jié)構(gòu)的橋粒與黏著連接。3 Calpain系統(tǒng)在閏盤形成過程中,既發(fā)揮穩(wěn)定作用,亦是塑形的重要工具免疫組化與免疫金標(biāo)電鏡觀測證實(shí):在心肌細(xì)胞閏盤處存在calpain-2和calpastatin的定位。隨著大鼠心肌的生長發(fā)育,calpastatin蛋白表達(dá)水平逐漸升高,calpain-2蛋白表達(dá)水平逐漸降低,至出生后第90天,calpastatin或calpain-2蛋白表達(dá)水平顯著高于或低于第1天表達(dá)水平。免疫組織化學(xué)觀察發(fā)現(xiàn),在心肌細(xì)胞縱軸末端處,calpastatin的定位更加早于N-cad和DSG-2,而calpain-2的定位則在N-cad和DSG-2之后;在心肌生長發(fā)育過程中,閏盤處calpastatin與N-cad的共定位程度逐漸增高(第7天為36.45%±0.68%,第14天為44.54%±0.84%,第28天為47.41%±1.49%。第90天為88.48%±0.42%),而calpain-2與N-cad的共定位程度逐漸降低(第7天為84.45%±0.99%,第14天為79.02%±1.79%,第28天為75.93%±1.37%。第90天為32.29%±1.93%)。因calpastatin為calpains的內(nèi)源性抑制物,這些結(jié)果提示N-cadherin和DSG-2在閏盤處的組裝,可能需要calpastatin首先提供一個穩(wěn)定的化學(xué)環(huán)境,而calpain-2則發(fā)揮不斷重塑閏盤的作用。【結(jié)論】本研究結(jié)果表明:在心肌細(xì)胞生長發(fā)育過程中,初級肌原纖維在斜行閏盤處加入,初級肌原纖維融合形成成熟肌原纖維,斜行閏盤轉(zhuǎn)化為成熟的閏盤,從而使心肌細(xì)胞不斷增寬。這一過程的分子機(jī)制可能涉及下列環(huán)節(jié):calpastatin最先在心肌細(xì)胞縱軸兩端集聚,形成穩(wěn)定的化學(xué)環(huán)境,接著橋粒與黏著連接蛋白在兩端處集聚與裝配,calpain-2可能參與橋粒/黏著連接的裝配塑形過程,最終形成成熟的閏盤,細(xì)胞膜彌散分布的閏盤結(jié)構(gòu)蛋白逐漸被降解,形成成熟的心肌細(xì)胞,完成其生理性肥大生長過程。
【關(guān)鍵詞】：大鼠 出生后發(fā)育 閏盤 跨膜蛋白 鈣蛋白酶系統(tǒng)
【學(xué)位授予單位】：第四軍醫(yī)大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2015
【分類號】：R54
【目錄】：

• 縮略語表4-5
• 中文摘要5-9
• 英文摘要9-14
• 前言14-16
• 文獻(xiàn)回顧16-27
• 第一部分 發(fā)育大鼠心肌細(xì)胞肌原纖維橫向加入模型27-48
• 1 引言27-28
• 2 材料與方法28-31
• 3 結(jié)果31-42
• 4 討論42-48
• 第二部分Calpain/calpastatin與閏盤蛋白裝配48-71
• 1 引言48-49
• 2 材料與方法49-54
• 3 結(jié)果54-68
• 4 討論68-71
• 小結(jié)71-73
• 參考文獻(xiàn)73-80
• 個人簡歷和研究成果80-81
• 致謝81

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3 葛s，

本文編號：568681