本文關(guān)鍵詞：運(yùn)動(dòng)應(yīng)激對(duì)大鼠心室肌細(xì)胞L型鈣離子通道的影響及機(jī)制

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【摘要】：目的:應(yīng)用膜片鉗技術(shù),探索運(yùn)動(dòng)應(yīng)激對(duì)大鼠心室肌細(xì)胞L型鈣離子通道的影響,并結(jié)合免疫組化的方法推測(cè)其可能存在的細(xì)胞內(nèi)機(jī)制。方法:Wister大鼠20只,采自于河北醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心,合格證號(hào)(1502056),體重200-250g,雌雄不限,隨機(jī)分為3個(gè)實(shí)驗(yàn)組:對(duì)照組(不給于運(yùn)動(dòng)干預(yù))、實(shí)驗(yàn)組:運(yùn)動(dòng)應(yīng)激組和運(yùn)動(dòng)應(yīng)激+藥物干預(yù)(每次運(yùn)動(dòng)前30min皮下注射salubrinal)。實(shí)驗(yàn)組大鼠頭部負(fù)重(5%體重)運(yùn)動(dòng)9天。實(shí)驗(yàn)前3天,為動(dòng)物適應(yīng)性訓(xùn)練期,運(yùn)動(dòng)應(yīng)激組+藥物干預(yù)組皮下注射用二甲基亞砜做溶劑的Salubrinal(1mg/kg),其余2組給予同等劑量的二甲基亞砜。隨后的9天實(shí)驗(yàn)中,給予大鼠皮下注射Salubrinal(0.5mg/kg),運(yùn)動(dòng)后動(dòng)物休息1天,繼而對(duì)大鼠進(jìn)行急性心肌細(xì)胞分離、膜片鉗記錄L型鈣離子電流和免疫組化進(jìn)行內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激標(biāo)記物水平的分析。大鼠心室肌細(xì)胞的分離:Wister大鼠,腹腔注射普通肝素5000U/Kg,20min后腹腔注射1%戊巴比妥1ml/Kg;待麻醉完成后迅速開胸,取出心臟;置于4℃無鈣臺(tái)式液中沖洗后轉(zhuǎn)入4℃無鈣臺(tái)式液培養(yǎng)皿中,游離主動(dòng)脈根部,插入主動(dòng)脈套管,安置于Langendorff灌流裝置上;以無鈣臺(tái)式液8-10ml/min的灌流速度,灌流5-7min后,改用消化酶液灌流20min,灌流溫度37℃,流速8-10ml/min。將心臟從Langendorff裝置上取下,置于37℃KB液中溫育5-10min;剪去心房和右心室,留取左心室游離壁,將左心室組織剪成2mm×2mm×2mm的碎塊,用粗開口巴氏吸管緩慢吹打5min。用200μm的微孔尼龍膜過濾。濾液于室溫下靜置30min,顯微鏡下觀察到上清液中多為死亡的心肌細(xì)胞或懸浮的細(xì)胞碎片時(shí)去除上清,加入KB液,重復(fù)3次,置于4℃保存?zhèn)溆�。�?xì)胞存活率的測(cè)定:2ml巴氏吸管吸取1ml的細(xì)胞懸浮液,滴于載玻片上,滴入1滴0.2%的臺(tái)盼藍(lán)染色,死亡的心室肌細(xì)胞會(huì)被染成淡藍(lán)色。存活的細(xì)胞仍然會(huì)保持透亮,光滑的狀態(tài)。存活率(%)=活細(xì)胞數(shù)/(活細(xì)胞數(shù)+死亡的細(xì)胞數(shù))×100%免疫組化:Western blot取分離好的心室肌細(xì)胞放入2.5ml離心管中,置于4℃離心機(jī)中12000轉(zhuǎn)/分離心15分鐘。充分棄上清液,加入裂解液50μl,4℃裂解30min后加入1:5上樣緩沖液,置于100℃的水浴鍋中煮沸10min。采用BCA法進(jìn)行蛋白定量后,進(jìn)行上樣開始SDS-PAGE凝膠電泳,完成電泳后將分離好的蛋白轉(zhuǎn)膜至PVDF膜。5%脫脂奶粉封閉1小時(shí)后,分別孵CHOP、phospho-e IF2α和caspase-12一抗置于4℃,10小時(shí)后,PBS洗脫一抗,孵二抗(HRP-conjugated antirabbit immunoglobulin G antibod),1小時(shí)后開始ECL發(fā)光,并用G-BOX檢測(cè)結(jié)果。應(yīng)用全細(xì)胞膜片鉗技術(shù),記錄急性分離的大鼠心室肌細(xì)胞L型鈣離子通道。用巴氏吸管吸取數(shù)滴心肌細(xì)胞的懸液置于倒置顯微鏡的灌流槽中,靜置5min待細(xì)胞貼壁后,利用記錄鈣離子的細(xì)胞外液(鈣外液)灌流(2ml/min)沖掉死亡的心肌細(xì)胞,選取貼壁較好、紋理清晰、邊緣整齊、透亮、靜止不動(dòng)且表面光滑的心肌細(xì)胞做全細(xì)胞膜片鉗記錄,電極為硬質(zhì)玻璃材質(zhì)(武漢微探極生產(chǎn)),經(jīng)過水平拉制儀(Sutter P-97 USA)四步拉制而成。然后用拋光儀(Narishige Scientific Instrument Lab.,Tokyo,Japan)對(duì)拉制好的微電極進(jìn)行拋光處理。電極充灌鈣離子通道極內(nèi)液。安裝于膜片鉗的夾持器上針筒給予正壓,操縱三維操縱器移動(dòng)電極至電極貼于細(xì)胞表面,釋放正壓并適當(dāng)給以負(fù)壓,使細(xì)胞與電極形成高阻封接(≥1G?)。調(diào)節(jié)快速補(bǔ)償,以抵消夾持器和電極管壁的快電容。繼續(xù)給予負(fù)壓吸破細(xì)胞膜,形成全細(xì)胞記錄,調(diào)節(jié)慢電容和串聯(lián)電阻以減少瞬時(shí)充放電時(shí)的電流鉗位誤差。脈沖信號(hào)由patchmaster軟件予以控制,通道信號(hào)由EPC-10(HEKA,Germany)膜片鉗放大器記錄并由patchmaster軟件對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行采集。實(shí)驗(yàn)在20-25℃的室溫條件下進(jìn)行,全細(xì)胞形成后穩(wěn)定2min后進(jìn)行數(shù)據(jù)的采集。結(jié)果:1與對(duì)照組(n=4)相比運(yùn)動(dòng)應(yīng)激組(n=4),內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激標(biāo)記物phospho-e IF2α(1±0.50 Vs 2.31±0.87,P=0.04)、CCAT/enhancer-binding homologous protein(CHOP)(1±0.30 Vs 3.13±1.20,P=0.034)和caspase-12表達(dá)均升高(1±0.44 Vs 2.6±0.84,P=0.014)并且存在統(tǒng)計(jì)學(xué)差異,推測(cè)運(yùn)動(dòng)應(yīng)激觸發(fā)了內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激的機(jī)制。與對(duì)照組(n=12)相比運(yùn)動(dòng)應(yīng)激組(n=9)的L型鈣離子通道電流密度峰值明顯減低(-3.80±1.26 Vs-2.24±1.11,P=0.009)說明運(yùn)動(dòng)應(yīng)激可以降低L型鈣離子通道電流。而這種降低可以被選擇性的e IF2α去磷酸化抑制劑salubrinal所阻斷,對(duì)照組(n=12)與運(yùn)動(dòng)應(yīng)激+salubrinal組(n=7)的L型鈣離子通道電流密度峰值變化沒有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(-3.80±1.26 Vs-3.82±1.49,P=0.979),運(yùn)動(dòng)應(yīng)激組(n=9)與運(yùn)動(dòng)應(yīng)激+salubrinal組(n=7)相比L型鈣離子通道電流密度峰值明顯減低(-2.24±1.11 Vs-3.82±1.49,P=0.03)。而salubrinal通常用于內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激的抑制劑,這就提示內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激可能參與了對(duì)L型鈣離子通道電流的調(diào)節(jié);2試驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)對(duì)照組(n=7,points=49),運(yùn)動(dòng)應(yīng)激組(n=9,points=63)和運(yùn)動(dòng)應(yīng)激+salubrinal組(n=12,points=84),運(yùn)動(dòng)應(yīng)激前后半數(shù)激活電壓(-21.06±1.07m V Vs-19.39±1.64m V Vs-17.69±1.26m V,P=0.96)的改變不存在統(tǒng)計(jì)學(xué)差異;對(duì)照組(n=7,points=42),運(yùn)動(dòng)應(yīng)激組(n=8,points=48)和運(yùn)動(dòng)應(yīng)激+salubrinal組(n=12,points=72)運(yùn)動(dòng)應(yīng)激前后半數(shù)失活電壓(-29.51±0.18 m V Vs-27.01±0.40 m V Vs-27.21±0.44 m V,P=0.98)的改變不存在統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。結(jié)論:1運(yùn)動(dòng)應(yīng)激后電壓依賴性L型鈣通道的電流減小。2運(yùn)動(dòng)應(yīng)激導(dǎo)致了內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激。3內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激參與了運(yùn)動(dòng)應(yīng)激對(duì)于L型鈣離子通道的調(diào)節(jié)。
【關(guān)鍵詞】：心肌細(xì)胞分離 膜片鉗 運(yùn)動(dòng)應(yīng)激 L型鈣離子通道 內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激
【學(xué)位授予單位】：河北醫(yī)科大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2016
【分類號(hào)】：R54
【目錄】：

• 中文摘要4-7
• 英文摘要7-10
• 英文縮寫10-11
• 前言11-13
• 材料與方法13-19
• 結(jié)果19-21
• 附圖21-26
• 討論26-29
• 結(jié)論29-30
• 參考文獻(xiàn)30-33
• 綜述 運(yùn)動(dòng)應(yīng)激對(duì)心血管系統(tǒng)的影響33-53
• 參考文獻(xiàn)44-53
• 致謝53-54
• 個(gè)人簡(jiǎn)歷54-55

【參考文獻(xiàn)】

中國(guó)期刊全文數(shù)據(jù)庫 前1條

1 溫悅萌;張?zhí)鞖W;謝嵐;艾華;管又飛;;一次性力竭運(yùn)動(dòng)對(duì)小鼠肝臟和骨骼肌內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激的影響[J];中國(guó)運(yùn)動(dòng)醫(yī)學(xué)雜志;2012年02期

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本文編號(hào)：567097