本文關(guān)鍵詞：二甲雙胍對尼古丁誘導(dǎo)肺動脈平滑肌細(xì)胞增殖的影響及機(jī)制研究

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【摘要】：研究背景肺動脈高壓(pulmonary hypertension,PH)作為慢性阻塞性肺病(chronic obstructive pulmonary disease,COPD)的重要并發(fā)癥之一,直接影響了COPD患者的生活質(zhì)量和預(yù)后。然而目前對于COPD相關(guān)PH尚無療效可靠的預(yù)防和治療措施。傳統(tǒng)觀念認(rèn)為COPD肺血管床毀損、由低氧導(dǎo)致的肺血管收縮和血管重構(gòu)是引起PH形成的主要機(jī)制,然而在治療上基于此理論而給予的治療手段包括氧療、血管擴(kuò)張劑及現(xiàn)有的用于治療PH的藥物和治療手段并不能逆轉(zhuǎn)COPD相關(guān)PH的持續(xù)進(jìn)展。因此我們必須重新審視COPD相關(guān)PH的發(fā)病機(jī)制,探索肺血管重塑的潛在致病因素,以期尋找早期有效的防治方法。80-90%COPD患者與吸煙有關(guān),研究證實吸煙致COPD患者的早期無低氧階段,甚至在肺功能正常階段,就已經(jīng)出現(xiàn)了肺血管重構(gòu)的現(xiàn)象;長期吸煙的PH患者中,其血循環(huán)中炎癥因子包括白介素(IL-6)、腫瘤壞死因子(TNF-а)、單核細(xì)胞趨化蛋白-1(MCP-1)等,和平均動脈壓有較強(qiáng)的直線相關(guān)性,高敏C反應(yīng)蛋白(hs-CRP)水平可作為肺動脈高壓的獨立預(yù)測因子。這些證據(jù)充分闡明了,在慢性阻塞性肺病患者合并PH的肺血管重構(gòu)過程中,吸煙所引起的肺血管的慢性炎癥扮演了重要的角色。肺血管重構(gòu)是PH的基本病理特征,其中肺動脈平滑肌細(xì)胞(pulmonary arterial smooth muscle cell,PASMCs)表型轉(zhuǎn)化-從收縮型(分化)向合成型(未分化)轉(zhuǎn)化(分化標(biāo)志物SMA,SM22α等下調(diào)或消失是PASMCs表型轉(zhuǎn)化的標(biāo)志),是獲得異常增殖/遷移、合成分泌能力致肺血管重構(gòu)和肺動脈高壓形成的前提和基礎(chǔ),盡管目前已公認(rèn)香煙致慢性炎癥在肺血管重構(gòu)中的關(guān)鍵地位,但涉及其中的確切機(jī)制并未闡明,尤其是香煙暴露下調(diào)控PASMC表型轉(zhuǎn)化的關(guān)鍵信號機(jī)制尚不清楚。調(diào)控細(xì)胞能量代謝平衡-腺苷酸活化蛋白激酶(AMP-activated protein kinase,AMPK)正作為調(diào)控機(jī)體氧化應(yīng)激和炎癥反應(yīng)的重要靶點備受關(guān)注。眾多的研究證據(jù)顯示,機(jī)體氧化應(yīng)激狀態(tài)和炎癥反應(yīng)程度的變化與AMPK活性改變有密切的關(guān)系,AMPK活性上調(diào)可明顯抑制炎癥反應(yīng)和基體高氧化應(yīng)激狀態(tài),從而起到保護(hù)基體組織的作用。臨床上廣泛使用的降糖藥物二甲雙胍(metformin)是ampk激活劑,2009年agard等(agardc.britishjournalofpharmacology,158:1285-1294,2009)的研究顯示二甲雙胍抑制野百合堿和低氧誘導(dǎo)的ph形成,此項研究雖然未直接探討其機(jī)制,但推測其機(jī)制可能與ampk激活有關(guān)。isoda等對內(nèi)皮細(xì)胞、平滑肌細(xì)胞及巨噬細(xì)胞的研究發(fā)現(xiàn),二甲雙胍通過ampk抑制nf-κb激活從而降低il-1β誘導(dǎo)的il-6等炎癥促進(jìn)因子的表達(dá)水平;提示二甲雙胍可能通過活化ampk,引起ampk磷酸化發(fā)揮抗炎作用�；谏鲜鲅芯拷Y(jié)果,我們推測ampk失活可能是吸煙copd患者肺血管重構(gòu)過程中的關(guān)鍵環(huán)節(jié),二甲雙胍上調(diào)ampk活性有望抑制氧化應(yīng)激、炎癥反應(yīng),阻止肺血管重構(gòu)和肺動脈高壓形成。本研究擬通過原代培養(yǎng)sd(spraguedawley)大鼠肺動脈平滑肌細(xì)胞,觀察二甲雙胍對尼古丁(nicotine)誘導(dǎo)的pasmcs增殖的影響,并探討其可能機(jī)制,最終為吸煙所致copd相關(guān)相關(guān)的防治提高新策略。研究目的1、明確不同濃度尼古丁對pasmcs增殖的影響2、明確二甲雙胍對尼古丁誘導(dǎo)pasmcs增殖的影響;3、明確二甲雙胍對尼古丁誘導(dǎo)pasmcs釋放il-6、tnf-α及ros生成的影響;4、探討二甲雙胍對尼古丁暴露下pasmcs中ampk表達(dá)和活性的影響。材料和方法實驗材料:雄性sd大鼠購自第三軍醫(yī)大學(xué)動物中心。實驗方法:1、pasmcs的原代培養(yǎng)及鑒定;2、cck-8法檢測不同濃度的尼古丁對pasmcs增殖的影響;3、cck-8法檢測二甲雙胍對尼古丁誘導(dǎo)pasmcs增殖的影響;4、elisa檢測試劑盒檢測尼古丁干預(yù)pasmcs后il-6和tnf-α釋放及二甲雙胍干預(yù)后il-6和tnf-α釋放水平變化;5、流式細(xì)胞技術(shù)檢測細(xì)胞活性氧(ros)水平6、westernblot檢測pasmcs中ampk蛋白的表達(dá)和活性變化;結(jié)果1、光鏡下可見,第3代細(xì)胞呈長梭形,典型的“峰-谷”樣生長。免疫熒光染色可見細(xì)胞質(zhì)內(nèi)α-actin蛋白fitc標(biāo)記的熒光二抗染成綠色,呈與細(xì)胞長軸平行的絲狀分布,經(jīng)DAPI染色的胞核為藍(lán)色;2、0.1μmol/L尼古丁促PASMCs增殖效應(yīng)最強(qiáng)(P0.05),2 mmol/L二甲雙胍干預(yù)后能顯著抑制尼古丁誘導(dǎo)的PASMCs增殖(P0.05);3、0.1μmol/L尼古丁可明顯促進(jìn)PASMCs中IL-6、TNF-α釋放,在6 h時達(dá)峰值;二甲雙胍處理后在6 h時能顯著降低IL-6、TNF-α的釋放水平(P0.05);4、0.1μmol/L尼古丁可顯著誘導(dǎo)PASMCs中ROS的生成,在1 h時達(dá)峰值(P0.05),隨后開始下降。而加入二甲雙胍干預(yù)1 h后ROS的生成水平明顯降低(P0.05);5、0.1μmol/L尼古丁處理PASMCs 1 h時,磷酸化AMPK水平顯著升高,隨后逐漸減低,而在各時相點AMPK表達(dá)水平無明顯變化。而加入二甲雙胍預(yù)處理PASMCs后,PASMCs中磷酸化AMPK水平在尼古丁處理1 h、6 h、12 h、24 h均持續(xù)活化,12 h后磷酸化AMPK水平明顯升高(P0.05)。結(jié)論1、0.1μmol/L尼古丁誘導(dǎo)PASMCs增殖,促進(jìn)PASMCs炎癥因子(IL-6、TNF-α)和氧自由基的釋放;伴隨AMPK表達(dá)變化。2、二甲雙胍顯著抑制尼古丁誘導(dǎo)的PASMCs增殖;二甲雙胍抑制尼古丁介導(dǎo)的PASMCs氧化應(yīng)激和炎癥反應(yīng)。3、二甲雙胍抑制尼古丁誘導(dǎo)的炎癥反應(yīng)、氧化應(yīng)激及肺動脈平滑肌細(xì)胞增殖,其可能的機(jī)制是促進(jìn)AMPK的持續(xù)活化。
【關(guān)鍵詞】：二甲雙胍 尼古丁 肺動脈平滑肌細(xì)胞 磷酸腺苷蛋白激酶 細(xì)胞增殖
【學(xué)位授予單位】：第三軍醫(yī)大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2015
【分類號】：R544.1
【目錄】：

• 中英文縮略詞表4-6
• 英文摘要6-9
• 中文摘要9-12
• 第一章 前言12-14
• 第二章 PASMCs的原代培養(yǎng)及鑒定14-18
• 2.1 材料與方法14-15
• 2.2 實驗方法15-16
• 2.3 實驗結(jié)果16-17
• 2.4 討論17-18
• 第三章 尼古丁對PASMCs增殖及炎癥反應(yīng)、氧化應(yīng)激狀態(tài)的影響18-25
• 3.1 材料與方法18-19
• 3.2 實驗方法19-21
• 3.3 實驗結(jié)果21-23
• 3.4 討論23-25
• 第四章 二甲雙胍對尼古丁誘導(dǎo)PASMCs增殖的影響及機(jī)制研究25-36
• 4.1 實驗材料25-28
• 4.2 實驗方法28-30
• 4.3 實驗結(jié)果30-34
• 4.4 討論34-36
• 全文結(jié)論36-37
• 本研究的創(chuàng)新之處37-38
• 參考文獻(xiàn)38-41
• 文獻(xiàn)綜述 慢性阻塞性肺疾病相關(guān)性肺動脈高壓的發(fā)病機(jī)制研究41-48
• 參考文獻(xiàn)45-48
• 碩士研究生在讀期間發(fā)表文章48-49
• 致謝49

【參考文獻(xiàn)】

中國期刊全文數(shù)據(jù)庫 前1條

1 涂洪波;白莉;;吸煙對肺血管重構(gòu)的作用機(jī)制[J];中華肺部疾病雜志(電子版);2015年01期

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本文編號：555405