本文關(guān)鍵詞：基底硬度對(duì)人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞黏附THP-1細(xì)胞及對(duì)其黏附相關(guān)分子表達(dá)的影響

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【摘要】：作為人類健康的首要“殺手”,心血管疾病(CardioVascular Disease,CVD)越發(fā)被重視�！吨袊�(guó)心血管病報(bào)告2013》中提到,在中國(guó)心血管疾病每年剝奪近400萬(wàn)人的生命,每死亡5人就有2人是因心血管疾病。血管僵化是心血管疾病的普遍特征。吸煙、挑食、運(yùn)動(dòng)量少等不良生活習(xí)慣以及年齡的增加促使血管壁彈力蛋白含量降低,而膠原蛋白的量卻與之相反的出現(xiàn)明顯的累積,加之膠原分子間大量的交聯(lián),最終導(dǎo)致血管僵硬。血管的僵硬為心血管疾病的發(fā)生提供了條件。另一方面,由黏附分子以及趨化因子介導(dǎo)的內(nèi)皮細(xì)胞與免疫細(xì)胞的黏附也是心血管疾病的關(guān)鍵步驟之一。有研究表明內(nèi)皮細(xì)胞中與黏附相關(guān)的分子會(huì)受到多重因素的影響,如細(xì)胞所處力學(xué)環(huán)境,相關(guān)基因的異常表達(dá),然而基底硬度變化作為心血管疾病的常見(jiàn)特征,是否會(huì)影響內(nèi)皮細(xì)胞與其他細(xì)胞間的黏附還研究較少。如能發(fā)現(xiàn)血管硬度變化對(duì)內(nèi)皮細(xì)胞黏附其他種細(xì)胞能力的影響,或許能給相關(guān)心血管疾病的防治開(kāi)拓新的視野。在本課題研究中,我們通過(guò)調(diào)節(jié)丙烯酰胺與甲叉雙丙烯酰胺的比例來(lái)得到不同硬度的聚丙烯酰胺水凝膠(Polyarcylamide gel,PA gel),從而模擬血管正常生理狀態(tài)和病變狀態(tài)下的硬度,進(jìn)而分析血管壁硬度的不同對(duì)血管內(nèi)皮細(xì)胞黏附人急性單核白血病細(xì)胞(Human acute monocytic leukemia cell,THP-1)以及對(duì)內(nèi)皮黏附相關(guān)分子表達(dá)的影響。主要研究?jī)?nèi)容和結(jié)論如下:(1)改變丙烯酰胺(Acrylamide,AM)、甲叉雙丙烯酰胺(Bis-acrylamide,Bis)的配比得到不同硬度的聚丙烯酰胺凝膠,以Sulfo-SANPAH為媒介將I型鼠尾膠原(Col-I)交聯(lián)于凝膠表面從而活化凝膠。借助動(dòng)靜態(tài)疲勞試驗(yàn)機(jī)對(duì)不同配比的水凝膠的楊氏模量E進(jìn)行檢測(cè),分別為11.15±0.1kPa,32.51±1.91kPa和80.64±2.11kPa,滿足模擬正常血管和病變血管硬度的要求。隨后,將培養(yǎng)于不同硬度基底上的人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞(Human umbilical vein endothelial cells,HUVECs)與THP-1細(xì)胞共培養(yǎng)分析基底硬度對(duì)內(nèi)皮細(xì)胞黏附THP-1細(xì)胞能力的影響,發(fā)現(xiàn)在接近生理硬度(30kPa左右)時(shí)內(nèi)皮細(xì)胞黏附的THP-1細(xì)胞最少。(2)為排除凝膠表面所裱稱Col-I對(duì)后續(xù)實(shí)驗(yàn)結(jié)果的影響,利用免疫熒光技術(shù)對(duì)不同硬度水凝膠表面的Col-I進(jìn)行分析,發(fā)現(xiàn)隨著硬度的變化Col-I的結(jié)合量并沒(méi)有明顯變化。隨后將HUVECs培養(yǎng)于不同硬度的水凝膠上,待細(xì)胞長(zhǎng)至80%以上,提取細(xì)胞的總RNA和全蛋白,利用熒光定量PCR、免疫熒光和免疫印跡技術(shù)分析硬度對(duì)內(nèi)皮細(xì)胞中與黏附相關(guān)的分子如血管細(xì)胞黏附分子-1(vascular cell adhesion molecule-1,VCAM-1)、細(xì)胞間黏附分子-1(intercellular cell adhesion molecule-1,ICAM-1)、單核細(xì)胞趨化因子-1(monocyte chemotactic protein 1,MCP-1)等的影響。從實(shí)驗(yàn)結(jié)果可以看出在正常生理硬度(30kPa左右)下內(nèi)皮細(xì)胞中與黏附相關(guān)的分子的RNA轉(zhuǎn)錄以及蛋白表達(dá)水平均比病理硬度(10kPa左右和80kPa左右)下低。有趣的是,我們發(fā)現(xiàn)培養(yǎng)于不同硬度水凝膠上的內(nèi)皮細(xì)胞中的分化抑制因子-1(inhibitors of differentiation-1,Id1)無(wú)論是mRNA水平還是蛋白水平其受影響趨勢(shì)均與上述黏附相關(guān)分子一致。(3)在發(fā)現(xiàn)不同硬度基底上培養(yǎng)的內(nèi)皮細(xì)胞中Id1因子的RNA轉(zhuǎn)錄水平、蛋白表達(dá)水平的變化趨勢(shì)與黏附相關(guān)分子一致的基礎(chǔ)上,我們構(gòu)建了Id1過(guò)表達(dá)的HUVECs來(lái)研究Id1是否與基底硬度影響內(nèi)皮中與黏附相關(guān)的分子的表達(dá)有關(guān)。對(duì)轉(zhuǎn)染細(xì)胞中Id1的RNA轉(zhuǎn)錄和蛋白表達(dá)進(jìn)行檢測(cè),確定獲得穩(wěn)定Id1高表達(dá)細(xì)胞后,通過(guò)熒光定量PCR和免疫印跡技術(shù)分析Id1過(guò)表達(dá)后內(nèi)皮細(xì)胞中的與黏附相關(guān)的分子的RNA轉(zhuǎn)錄、蛋白表達(dá)水平。結(jié)果顯示Id1過(guò)表達(dá)時(shí)黏附分子的RNA轉(zhuǎn)錄和蛋白表達(dá)量也都增加,類似于病理硬度水凝膠上所得結(jié)果。通過(guò)本研究工作我們發(fā)現(xiàn)內(nèi)皮細(xì)胞生長(zhǎng)環(huán)境的硬度變化會(huì)改變其黏附相關(guān)分子的表達(dá),即在病理硬度情況下黏附相關(guān)分子高表達(dá),而同樣,在病理硬度下Id1也高表達(dá)。并且,過(guò)表達(dá)Id1后黏附相關(guān)分子的表達(dá)會(huì)出現(xiàn)上升。綜上所述,我們可以得出結(jié)論,基底硬度對(duì)內(nèi)皮細(xì)胞黏附相關(guān)分子的影響可能是通過(guò)Id1來(lái)介導(dǎo)的。
【關(guān)鍵詞】：聚丙烯酰胺水凝膠 分化抑制因子1(Id1) 血管硬度 內(nèi)皮細(xì)胞 黏附相關(guān)分子
【學(xué)位授予單位】：重慶大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2016
【分類號(hào)】：R54
【目錄】：

• 中文摘要3-5
• 英文摘要5-10
• 主要縮略詞表10-11
• 1 緒論11-20
• 1.1 問(wèn)題的提出與研究意義11-12
• 1.2 血管彈性模量的變化及影響因素12-13
• 1.3 血管硬度變化在心血管疾病中的影響13-14
• 1.3.1 血管硬度變化與動(dòng)脈粥樣硬化13
• 1.3.2 血管硬度變化與高血壓13-14
• 1.4 血管硬度影響心血管疾病中內(nèi)皮細(xì)胞的細(xì)胞黏附研究進(jìn)展14-17
• 1.4.1 血管硬度變化概述14
• 1.4.2 心血管疾病中的細(xì)胞黏附14-16
• 1.4.3 血管硬度在調(diào)節(jié)細(xì)胞黏附相關(guān)分子中的作用和爭(zhēng)議16-17
• 1.5 本文的研究目的、研究?jī)?nèi)容17-18
• 1.5.1 研究目的17-18
• 1.5.2 研究主要內(nèi)容18
• 1.6 本課題創(chuàng)新點(diǎn)18-20
• 2 基底硬度影響內(nèi)皮細(xì)胞的黏附20-29
• 2.1 引言20
• 2.2 材料與方法20-24
• 2.2.1 主要儀器和試劑20-21
• 2.2.2 硬度差異性聚丙烯酰胺水凝膠的制備21-22
• 2.2.3 不同配比聚丙烯酰胺水凝膠的楊氏模量測(cè)定22-23
• 2.2.4 共培養(yǎng)23
• 2.2.5 統(tǒng)計(jì)分析23-24
• 2.3 實(shí)驗(yàn)結(jié)果24-27
• 2.3.1 不同配比聚丙烯酰胺水凝膠的楊氏模量測(cè)定24-25
• 2.3.2 基底硬度影響人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞的黏附能力25-27
• 2.4 討論27
• 2.4.1 以聚丙烯酰胺水凝膠作為基底研究細(xì)胞行為的可行性27
• 2.4.2 細(xì)胞共培養(yǎng)檢測(cè)方法的選擇27
• 2.5 小結(jié)27-29
• 3 基底硬度影響人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞的黏附相關(guān)分子表達(dá)29-45
• 3.1 引言29-30
• 3.2 材料與方法30-36
• 3.2.1 主要儀器和試劑30-31
• 3.2.2 不同硬度聚丙烯酰胺水凝膠表面細(xì)胞培養(yǎng)31-32
• 3.2.3 免疫熒光染色32
• 3.2.4 熒光定量PCR32-35
• 3.2.5 Western blot35-36
• 3.2.6 統(tǒng)計(jì)分析36
• 3.3 實(shí)驗(yàn)結(jié)果36-42
• 3.3.1 聚丙烯酰胺水凝膠表面膠原蛋白免疫熒光36-37
• 3.3.2 基底硬度影響人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞黏附相關(guān)分子表達(dá)37-40
• 3.3.3 基底硬度對(duì)人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞中Id1表達(dá)的影響40-42
• 3.4 討論42-44
• 3.4.1 黏附相關(guān)分子的選擇42-43
• 3.4.2 選擇Id1的原因43-44
• 3.5 小結(jié)44-45
• 4 Id1影響人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞黏附相關(guān)分子45-59
• 4.1 引言45-46
• 4.2 材料與方法46-51
• 4.2.1 主要儀器和試劑46-47
• 4.2.2 Id1過(guò)表達(dá)慢病毒載體的構(gòu)建47-49
• 4.2.3 人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞的慢病毒轉(zhuǎn)染49
• 4.2.4 轉(zhuǎn)染細(xì)胞熒光檢測(cè)49-50
• 4.2.5 熒光定量PCR50
• 4.2.6 Western blot50
• 4.2.7 ELISA檢測(cè)MCP-1 分泌50-51
• 4.2.8 統(tǒng)計(jì)分析51
• 4.3 實(shí)驗(yàn)結(jié)果51-57
• 4.3.1 Id1的慢病毒載體構(gòu)建和包裝51-52
• 4.3.2 人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞的慢病毒轉(zhuǎn)染鑒定52-54
• 4.3.3 Id1過(guò)表達(dá)對(duì)人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞黏附相關(guān)分子的影響54-57
• 4.4 討論57-58
• 4.5 小結(jié)58-59
• 5 結(jié)論與展望59-61
• 5.1 主要結(jié)論59-60
• 5.2 展望60-61
• 致謝61-62
• 參考文獻(xiàn)62-69
• 附錄69
• A. 作者在攻讀碩士期間發(fā)表的論文目錄69
• B. 作者在攻讀碩士學(xué)位期間參與的科研項(xiàng)目69

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9 苑t，

本文編號(hào)：524217