本文關鍵詞：基底硬度對人臍靜脈內皮細胞黏附THP-1細胞及對其黏附相關分子表達的影響

  更多相關文章： 聚丙烯酰胺水凝膠 分化抑制因子1(Id1) 血管硬度 內皮細胞 黏附相關分子

【摘要】：作為人類健康的首要“殺手”,心血管疾病(CardioVascular Disease,CVD)越發(fā)被重視。《中國心血管病報告2013》中提到,在中國心血管疾病每年剝奪近400萬人的生命,每死亡5人就有2人是因心血管疾病。血管僵化是心血管疾病的普遍特征。吸煙、挑食、運動量少等不良生活習慣以及年齡的增加促使血管壁彈力蛋白含量降低,而膠原蛋白的量卻與之相反的出現(xiàn)明顯的累積,加之膠原分子間大量的交聯(lián),最終導致血管僵硬。血管的僵硬為心血管疾病的發(fā)生提供了條件。另一方面,由黏附分子以及趨化因子介導的內皮細胞與免疫細胞的黏附也是心血管疾病的關鍵步驟之一。有研究表明內皮細胞中與黏附相關的分子會受到多重因素的影響,如細胞所處力學環(huán)境,相關基因的異常表達,然而基底硬度變化作為心血管疾病的常見特征,是否會影響內皮細胞與其他細胞間的黏附還研究較少。如能發(fā)現(xiàn)血管硬度變化對內皮細胞黏附其他種細胞能力的影響,或許能給相關心血管疾病的防治開拓新的視野。在本課題研究中,我們通過調節(jié)丙烯酰胺與甲叉雙丙烯酰胺的比例來得到不同硬度的聚丙烯酰胺水凝膠(Polyarcylamide gel,PA gel),從而模擬血管正常生理狀態(tài)和病變狀態(tài)下的硬度,進而分析血管壁硬度的不同對血管內皮細胞黏附人急性單核白血病細胞(Human acute monocytic leukemia cell,THP-1)以及對內皮黏附相關分子表達的影響。主要研究內容和結論如下:(1)改變丙烯酰胺(Acrylamide,AM)、甲叉雙丙烯酰胺(Bis-acrylamide,Bis)的配比得到不同硬度的聚丙烯酰胺凝膠,以Sulfo-SANPAH為媒介將I型鼠尾膠原(Col-I)交聯(lián)于凝膠表面從而活化凝膠。借助動靜態(tài)疲勞試驗機對不同配比的水凝膠的楊氏模量E進行檢測,分別為11.15±0.1kPa,32.51±1.91kPa和80.64±2.11kPa,滿足模擬正常血管和病變血管硬度的要求。隨后,將培養(yǎng)于不同硬度基底上的人臍靜脈內皮細胞(Human umbilical vein endothelial cells,HUVECs)與THP-1細胞共培養(yǎng)分析基底硬度對內皮細胞黏附THP-1細胞能力的影響,發(fā)現(xiàn)在接近生理硬度(30kPa左右)時內皮細胞黏附的THP-1細胞最少。(2)為排除凝膠表面所裱稱Col-I對后續(xù)實驗結果的影響,利用免疫熒光技術對不同硬度水凝膠表面的Col-I進行分析,發(fā)現(xiàn)隨著硬度的變化Col-I的結合量并沒有明顯變化。隨后將HUVECs培養(yǎng)于不同硬度的水凝膠上,待細胞長至80%以上,提取細胞的總RNA和全蛋白,利用熒光定量PCR、免疫熒光和免疫印跡技術分析硬度對內皮細胞中與黏附相關的分子如血管細胞黏附分子-1(vascular cell adhesion molecule-1,VCAM-1)、細胞間黏附分子-1(intercellular cell adhesion molecule-1,ICAM-1)、單核細胞趨化因子-1(monocyte chemotactic protein 1,MCP-1)等的影響。從實驗結果可以看出在正常生理硬度(30kPa左右)下內皮細胞中與黏附相關的分子的RNA轉錄以及蛋白表達水平均比病理硬度(10kPa左右和80kPa左右)下低。有趣的是,我們發(fā)現(xiàn)培養(yǎng)于不同硬度水凝膠上的內皮細胞中的分化抑制因子-1(inhibitors of differentiation-1,Id1)無論是mRNA水平還是蛋白水平其受影響趨勢均與上述黏附相關分子一致。(3)在發(fā)現(xiàn)不同硬度基底上培養(yǎng)的內皮細胞中Id1因子的RNA轉錄水平、蛋白表達水平的變化趨勢與黏附相關分子一致的基礎上,我們構建了Id1過表達的HUVECs來研究Id1是否與基底硬度影響內皮中與黏附相關的分子的表達有關。對轉染細胞中Id1的RNA轉錄和蛋白表達進行檢測,確定獲得穩(wěn)定Id1高表達細胞后,通過熒光定量PCR和免疫印跡技術分析Id1過表達后內皮細胞中的與黏附相關的分子的RNA轉錄、蛋白表達水平。結果顯示Id1過表達時黏附分子的RNA轉錄和蛋白表達量也都增加,類似于病理硬度水凝膠上所得結果。通過本研究工作我們發(fā)現(xiàn)內皮細胞生長環(huán)境的硬度變化會改變其黏附相關分子的表達,即在病理硬度情況下黏附相關分子高表達,而同樣,在病理硬度下Id1也高表達。并且,過表達Id1后黏附相關分子的表達會出現(xiàn)上升。綜上所述,我們可以得出結論,基底硬度對內皮細胞黏附相關分子的影響可能是通過Id1來介導的。
【關鍵詞】：聚丙烯酰胺水凝膠 分化抑制因子1(Id1) 血管硬度 內皮細胞 黏附相關分子
【學位授予單位】：重慶大學
【學位級別】：碩士
【學位授予年份】：2016
【分類號】：R54
【目錄】：

• 中文摘要3-5
• 英文摘要5-10
• 主要縮略詞表10-11
• 1 緒論11-20
• 1.1 問題的提出與研究意義11-12
• 1.2 血管彈性模量的變化及影響因素12-13
• 1.3 血管硬度變化在心血管疾病中的影響13-14
• 1.3.1 血管硬度變化與動脈粥樣硬化13
• 1.3.2 血管硬度變化與高血壓13-14
• 1.4 血管硬度影響心血管疾病中內皮細胞的細胞黏附研究進展14-17
• 1.4.1 血管硬度變化概述14
• 1.4.2 心血管疾病中的細胞黏附14-16
• 1.4.3 血管硬度在調節(jié)細胞黏附相關分子中的作用和爭議16-17
• 1.5 本文的研究目的、研究內容17-18
• 1.5.1 研究目的17-18
• 1.5.2 研究主要內容18
• 1.6 本課題創(chuàng)新點18-20
• 2 基底硬度影響內皮細胞的黏附20-29
• 2.1 引言20
• 2.2 材料與方法20-24
• 2.2.1 主要儀器和試劑20-21
• 2.2.2 硬度差異性聚丙烯酰胺水凝膠的制備21-22
• 2.2.3 不同配比聚丙烯酰胺水凝膠的楊氏模量測定22-23
• 2.2.4 共培養(yǎng)23
• 2.2.5 統(tǒng)計分析23-24
• 2.3 實驗結果24-27
• 2.3.1 不同配比聚丙烯酰胺水凝膠的楊氏模量測定24-25
• 2.3.2 基底硬度影響人臍靜脈內皮細胞的黏附能力25-27
• 2.4 討論27
• 2.4.1 以聚丙烯酰胺水凝膠作為基底研究細胞行為的可行性27
• 2.4.2 細胞共培養(yǎng)檢測方法的選擇27
• 2.5 小結27-29
• 3 基底硬度影響人臍靜脈內皮細胞的黏附相關分子表達29-45
• 3.1 引言29-30
• 3.2 材料與方法30-36
• 3.2.1 主要儀器和試劑30-31
• 3.2.2 不同硬度聚丙烯酰胺水凝膠表面細胞培養(yǎng)31-32
• 3.2.3 免疫熒光染色32
• 3.2.4 熒光定量PCR32-35
• 3.2.5 Western blot35-36
• 3.2.6 統(tǒng)計分析36
• 3.3 實驗結果36-42
• 3.3.1 聚丙烯酰胺水凝膠表面膠原蛋白免疫熒光36-37
• 3.3.2 基底硬度影響人臍靜脈內皮細胞黏附相關分子表達37-40
• 3.3.3 基底硬度對人臍靜脈內皮細胞中Id1表達的影響40-42
• 3.4 討論42-44
• 3.4.1 黏附相關分子的選擇42-43
• 3.4.2 選擇Id1的原因43-44
• 3.5 小結44-45
• 4 Id1影響人臍靜脈內皮細胞黏附相關分子45-59
• 4.1 引言45-46
• 4.2 材料與方法46-51
• 4.2.1 主要儀器和試劑46-47
• 4.2.2 Id1過表達慢病毒載體的構建47-49
• 4.2.3 人臍靜脈內皮細胞的慢病毒轉染49
• 4.2.4 轉染細胞熒光檢測49-50
• 4.2.5 熒光定量PCR50
• 4.2.6 Western blot50
• 4.2.7 ELISA檢測MCP-1 分泌50-51
• 4.2.8 統(tǒng)計分析51
• 4.3 實驗結果51-57
• 4.3.1 Id1的慢病毒載體構建和包裝51-52
• 4.3.2 人臍靜脈內皮細胞的慢病毒轉染鑒定52-54
• 4.3.3 Id1過表達對人臍靜脈內皮細胞黏附相關分子的影響54-57
• 4.4 討論57-58
• 4.5 小結58-59
• 5 結論與展望59-61
• 5.1 主要結論59-60
• 5.2 展望60-61
• 致謝61-62
• 參考文獻62-69
• 附錄69
• A. 作者在攻讀碩士期間發(fā)表的論文目錄69
• B. 作者在攻讀碩士學位期間參與的科研項目69

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