本文關(guān)鍵詞：沉默HO-1增強(qiáng)低濃度5-氮雜胞苷誘導(dǎo)SKM-1細(xì)胞凋亡的作用及機(jī)制研究，由筆耕文化傳播整理發(fā)布。

【摘要】：目的:探討慢病毒介導(dǎo)小干擾RNA沉默HO-1增強(qiáng)低濃度5-氮雜胞苷誘導(dǎo)SKM-1細(xì)胞凋亡的作用及其機(jī)制。方法:Real-time PCR檢測MDS/AML細(xì)胞株在5-氮雜胞苷加藥前后以及MDS患者(n=48)骨髓血單個核細(xì)胞HO-1基因表達(dá);經(jīng)慢病毒介導(dǎo)小干擾RNA轉(zhuǎn)染SKM-1細(xì)胞以沉默HO-1基因表達(dá),并分組為空白組、空載體組、沉默HO-1組,三組細(xì)胞分別予以5-氮雜胞苷、Hemin聯(lián)合5-氮雜胞苷處理;MTT法檢測調(diào)控HO-1表達(dá)后,低濃度5-氮雜胞苷對SKM-1細(xì)胞生長抑制的影響;流式細(xì)胞術(shù)檢測調(diào)控HO-1表達(dá)后,低濃度5-氮雜胞苷對SKM-1細(xì)胞凋亡及周期的影響;Real-time PCR檢測調(diào)控HO-1表達(dá)后,DNMT1、p16及p16下游相關(guān)周期基因(CDK4、CDK6、CyclinD1、p21、p27、p57、RB及E2F1)表達(dá);Western blot進(jìn)一步分析p16下游相關(guān)周期蛋白(CDK4、CDK6、CyclinD1、pRB、E2F1及p27)及凋亡蛋白(Caspase-3、Cleaved caspase-3、BCL-2及Bax)表達(dá);甲基化特異性PCR分析調(diào)控HO-1表達(dá)后,p16基因啟動子的甲基化程度的改變;建立空白組、空載體組、沉默HO-1組SKM-1細(xì)胞NOD/SCID小鼠血液腫瘤模型,并分別予以生理鹽水或5-氮雜胞苷治療,記錄其體重變化及生存時間,瑞氏染色檢測荷瘤小鼠外周血SKM-1細(xì)胞,流式細(xì)胞術(shù)檢測荷瘤小鼠外周血人CD45+SKM-1細(xì)胞比例。結(jié)果:SKM-1細(xì)胞在經(jīng)5-氮雜胞苷作用后,HO-1基因表達(dá)增加(P0.05),且高危組與極高危組MDS患者骨髓血單個核細(xì)胞HO-1表達(dá)較低危組增高(P0.05);MTT結(jié)果顯示,5-氮雜胞苷以濃度依賴性方式抑制SKM-1細(xì)胞生長,而沉默HO-1后,SKM-1細(xì)胞的生長抑制率較空白組和空載體組均增加(P0.05),而經(jīng)Hemin上調(diào)HO-1表達(dá)則明顯減弱5-氮雜胞苷誘導(dǎo)的SKM-1細(xì)胞生長抑制效應(yīng);流式細(xì)胞術(shù)結(jié)果顯示,沉默HO-1表達(dá)后,5-氮雜胞苷誘導(dǎo)的SKM-1細(xì)胞凋亡率由空載體組:28.08%±0.04增加到48.64%±0.09(P0.05),而經(jīng)Hemin聯(lián)合5-氮雜胞苷處理后,空載體組、沉默HO-1組凋亡率則分別下降為15.95%±0.04、31.43%±0.07,且沉默HO-1促進(jìn)5-氮雜胞苷誘導(dǎo)的SKM-1細(xì)胞凋亡依賴于Caspase-3凋亡途徑;沉默HO-1表達(dá)后,5-氮雜胞苷誘導(dǎo)的SKM-1細(xì)胞G0/G1期阻滯由空載體組:30.03%±0.05增加到59.39%±0.11(P0.05),而經(jīng)Hemin聯(lián)合5-氮雜胞苷處理后,空載體組、沉默HO-1組SKM-1細(xì)胞G0/G1期比例均分別下降為21.58%±0.03、39.29%±0.04;Real-time PCR結(jié)果顯示,在5-氮雜胞苷加藥的情況下,與空載體組相比,沉默HO-1組SKM-1細(xì)胞DNMT1表達(dá)明顯減弱,p16表達(dá)顯著增加,p16下游周期相關(guān)基因CDK4、CDK6、RB、E2F1表達(dá)減低,p27表達(dá)增加(P0.05);Western blot結(jié)果顯示,在5-氮雜胞苷加藥的情況下,與空載體組相比,沉默HO-1組SKM-1細(xì)胞p16表達(dá)增加,p16下游周期蛋白CDK4、CDK6、pRB、E2F1表達(dá)減低,p27表達(dá)增加(P0.05),同時,凋亡蛋白Cleaved caspase-3、Bax表達(dá)增加及BCL-2表達(dá)減低(P0.05);甲基化特異性PCR結(jié)果顯示,沉默HO-1顯著增加5-氮雜胞苷誘導(dǎo)的p16基因啟動子去甲基化水平(P0.05),而經(jīng)Hemin上調(diào)HO-1表達(dá)則可以減弱AZA誘導(dǎo)的p16基因啟動子去甲基化作用;體內(nèi)研究表明,與5-氮雜胞苷治療的空載體組荷瘤小鼠相比,經(jīng)5-氮雜胞苷治療的沉默HO-1組荷瘤小鼠體重減輕程度降低,生存時間延長,小鼠外周血SKM-1細(xì)胞數(shù)量明顯減少,小鼠外周血人CD45+SKM-1細(xì)胞比例顯著減低(P0.05)。結(jié)論:沉默HO-1增強(qiáng)5-氮雜胞苷對SKM-1細(xì)胞的生長抑制、細(xì)胞凋亡及細(xì)胞周期阻滯效應(yīng),其機(jī)制可能與沉默HO-1促進(jìn)5-氮雜胞苷對p16基因去甲基化作用相關(guān),同時,Cleaved caspase-3凋亡分子表達(dá)增加、BCL-2/Bax比值降低。因此,HO-1可能是增強(qiáng)AZA治療MDS轉(zhuǎn)化為AML的靶點(diǎn)之一,這為臨床治療高危MDS提供新思路。
【關(guān)鍵詞】：骨髓增生異常綜合征 SKM-1 5-氮雜胞苷 HO-1 p16
【學(xué)位授予單位】：貴州醫(yī)科大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2016
【分類號】：R551.3
【目錄】：

• 中文摘要4-6
• 英文摘要6-9
• 略縮詞表9-10
• 引言10-11
• 材料與方法11-25
• 結(jié)果25-40
• 討論40-44
• 結(jié)論44-45
• 參考文獻(xiàn)45-49
• 綜述49-61
• 參考文獻(xiàn)55-61
• 作者簡歷61-62
• 致謝62-63
• 學(xué)位論文數(shù)據(jù)集63

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本文編號：508532