本文關(guān)鍵詞：HFHG5基因的功能研究，由筆耕文化傳播整理發(fā)布。

【摘要】：據(jù)世界衛(wèi)生組織最新統(tǒng)計(jì),心臟病以12.9%致死率位居疾病的首位。該疾病已成為科學(xué)家們急待解決的世界性難題。已知心臟病的早期癥狀可表現(xiàn)為病理性心肌肥大。因此,從分子學(xué)水平上系統(tǒng)地研究心肌肥大的調(diào)控機(jī)制,將為治愈心臟病提供理論指導(dǎo)。已有研究表明,在小鼠模型(主動(dòng)脈捆扎法)及病人組織樣本中HFHG5的表達(dá)均上調(diào),這暗示了心肌肥厚的發(fā)生可能與HFHG5相關(guān)。本實(shí)驗(yàn)室通過(guò)熒光素報(bào)告系統(tǒng)分析及CO-IP實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn),HFHG5與Smad3/4存在相互作用,這暗示了HFHG5很可能通過(guò)TGF-β/Smads信號(hào)途徑進(jìn)行調(diào)控心肌肥大的發(fā)生,但其機(jī)制尚未被研究。接下來(lái)的研究就此展開(kāi)。為了研究HFHG5基因調(diào)控心肌肥大發(fā)生的機(jī)制,本文開(kāi)展了下述研究:(1)構(gòu)建了重組腺病毒載體pAd-HFHG5并制備了腺病毒,經(jīng)驗(yàn)證腺病毒Ad HFHG5構(gòu)建成功。Ad HFHG5主要用于新生大鼠原代心肌細(xì)胞中過(guò)表達(dá)HFHG5的實(shí)驗(yàn)。同時(shí),成功構(gòu)建了干擾載體pSuper-HFHG5-shRNA及驗(yàn)證了實(shí)驗(yàn)室已有的過(guò)表達(dá)載體p CMV-Myc-h-HFHG5,這一對(duì)載體主要用于體外干擾和過(guò)表達(dá)HFHG5的細(xì)胞實(shí)驗(yàn)。(2)利用PE及FBS分別刺激新生大鼠原代心肌細(xì)胞(AdGFP組及AdHFHG5組),檢測(cè)到HFHG5表達(dá)在肥大刺激后均會(huì)發(fā)生上調(diào),這表明HFHG5與心肌肥大相關(guān)。(3)通過(guò)免疫熒光實(shí)驗(yàn)研究HFHG5與Smad4的定位情況,發(fā)現(xiàn)HFHG5在細(xì)胞質(zhì)和細(xì)胞核中均有表達(dá),且在細(xì)胞質(zhì)中與Smad4存在共定位。(4)Western blot實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn),過(guò)表達(dá)HFHG5促進(jìn)了Smad4入核,而干擾HFHG5會(huì)抑制Smad4入核,這證明了HFHG5通過(guò)促進(jìn)Smad4的入核,參與TGF-β/Smads信號(hào)途徑的調(diào)控。(5)初步研究了HFHG5與Smad4協(xié)同入核后的下游調(diào)控機(jī)制。RT-PCR實(shí)驗(yàn)證明HFHG5與Smad4協(xié)同入核后可以激活下游肥大相關(guān)基因的表達(dá),表明HFHG5促進(jìn)心肌肥大發(fā)生的分子機(jī)制主要是HFHG5與Smad4協(xié)同入核調(diào)控下游肥大基因的轉(zhuǎn)錄。總之,以上實(shí)驗(yàn)表明HFHG5與Smad4相互作用,通過(guò)TGF-β/Smads信號(hào)途徑調(diào)控心肌肥大的發(fā)生。這些結(jié)果為針對(duì)心肌肥大疾病的治療策略提供了新的線索。
【關(guān)鍵詞】：HFHG5 Smad4 心肌肥大 TGF-β/Smads信號(hào)途徑 腺病毒載體
【學(xué)位授予單位】：湖南師范大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2016
【分類號(hào)】：R542.2
【目錄】：

• 摘要4-6
• ABSTRACT6-13
• 1 引文和文獻(xiàn)綜述13-20
• 1.1 心臟發(fā)育過(guò)程13-14
• 1.2 模式動(dòng)物—小鼠14
• 1.3 TGF-β/Smads信號(hào)途徑及其與心肌肥大的關(guān)系14-18
• 1.3.1 TGF-β 超家族14-15
• 1.3.2 Smads蛋白家族15-17
• 1.3.3 TGF-β 信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)的Smads通路17
• 1.3.4 TGF-β/Smads信號(hào)通路與心肌肥大的關(guān)系17-18
• 1.4 本文研究意義18-20
• 2 材料與方法20-45
• 2.1 材料20-26
• 2.1.1 所用生物信息學(xué)工具20-21
• 2.1.2 主要試劑和儀器21-22
• 2.1.3 質(zhì)粒22-26
• 2.1.3.1 腺病毒包裝質(zhì)粒22-23
• 2.1.3.2 表達(dá)型質(zhì)粒23-25
• 2.1.3.3 克隆型質(zhì)粒25-26
• 2.2 腺病毒構(gòu)建方法26-37
• 2.2.1 主要試劑配制26
• 2.2.2 重組質(zhì)粒pMD18-T-HFHG5的構(gòu)建26-30
• 2.2.2.1 總RNA的抽提26-27
• 2.2.2.2 反轉(zhuǎn)錄RT-PCR27
• 2.2.2.3 PCR產(chǎn)物的純化回收27-28
• 2.2.2.4 連接T載體28
• 2.2.2.5 感受態(tài)細(xì)胞DH5a的制備28-29
• 2.2.2.6 轉(zhuǎn)化及擴(kuò)培（熱休克法）29
• 2.2.2.7 質(zhì)粒的制備29-30
• 2.2.2.8 質(zhì)粒酶切30
• 2.2.3 穿梭質(zhì)粒pAdTrack-HFHG5的構(gòu)建30-32
• 2.2.3.1 穿梭質(zhì)粒pAdTrack-CMV的線性化31
• 2.2.3.2 目的片段與線性化pAdTrack-CMV載體連接、轉(zhuǎn)化及擴(kuò)培31
• 2.2.3.3 重組質(zhì)粒的酶切鑒定31
• 2.2.3.4 重組質(zhì)粒的測(cè)序31-32
• 2.2.4 重組腺病毒載體Ad-HFHG5的構(gòu)建32-35
• 2.2.4.1 穿梭質(zhì)粒pAdTrack-HFHG5的單酶切線性化32
• 2.2.4.2 電轉(zhuǎn)化感受態(tài)細(xì)菌的制備32-33
• 2.2.4.3 線性化的pAdTrack-HFHG5穿梭載體轉(zhuǎn)化33
• 2.2.4.4 重組腺病毒載體pAd-HFHG5篩選33-34
• 2.2.4.5 提取無(wú)內(nèi)毒素質(zhì)粒34
• 2.2.4.6 重組腺病毒載體pAd-HFHG5單酶切及鑒定34-35
• 2.2.5 腺病毒的制備35-37
• 2.2.5.1 準(zhǔn)備 293A細(xì)胞35
• 2.2.5.2 轉(zhuǎn)染實(shí)驗(yàn)35
• 2.2.5.3 收集病毒35-36
• 2.2.5.4 擴(kuò)增病毒36-37
• 2.3 新生大鼠原代心肌細(xì)胞的分離與培養(yǎng)37
• 2.4 重組質(zhì)粒pSuper-HFHG5-shRNA構(gòu)建方法37-40
• 2.4.1 設(shè)計(jì)HFHG5 shRNA模板寡核苷酸37-39
• 2.4.2 正反義鏈的退火反應(yīng)39
• 2.4.3 pSuper質(zhì)粒的雙酶切線性化39-40
• 2.4.4 退火目的片段與線性化pSuper的連接、轉(zhuǎn)化及擴(kuò)培40
• 2.4.5 重組質(zhì)粒的酶切鑒定40
• 2.4.6 shRNA干擾效率的驗(yàn)證40
• 2.5 免疫熒光實(shí)驗(yàn)40-42
• 2.6 提取核質(zhì)蛋白及Western blot實(shí)驗(yàn)42-45
• 2.6.1 細(xì)胞核/質(zhì)蛋白的提取42
• 2.6.2 Western blot實(shí)驗(yàn)42-45
• 3 實(shí)驗(yàn)結(jié)果及其分析45-55
• 3.1 腺病毒Ad-HFHG5的制備45-47
• 3.1.1 穿梭質(zhì)粒pAdTrack-HFHG5的構(gòu)建及鑒定45
• 3.1.2 穿梭質(zhì)粒pAdTrack-HFHG5的測(cè)序鑒定45-46
• 3.1.3 重組腺病毒載體pAd-HFHG5的酶切鑒定46-47
• 3.1.4 線性化重組腺病毒載體pAd-HFHG5轉(zhuǎn)染HEK293A細(xì)胞47
• 3.2 重組質(zhì)粒pSuper-HFHG5-shRNA構(gòu)建47-50
• 3.2.1 退火反應(yīng)合成目的片段47-48
• 3.2.2 重組質(zhì)粒pSuper-HFHG5-shRNA的酶切鑒定48-49
• 3.2.3 驗(yàn)證pSuper-HFHG5-shRNA對(duì)HFHG5表達(dá)的干擾效率49-50
• 3.3 重組質(zhì)粒pCMV-Myc-h-HFHG5的鑒定50
• 3.4 PE及FBS刺激原代心肌細(xì)胞，HFHG5的表達(dá)會(huì)發(fā)生上調(diào)50-52
• 3.5 HFHG5與Smad4在亞細(xì)胞中有共定位52
• 3.6 HFHG5通過(guò)促進(jìn)Smad4入核，從而促進(jìn)了心肌肥大52-55
• 3.6.1 過(guò)表達(dá)HFHG5促進(jìn)Smad4的入核52-53
• 3.6.2 促進(jìn)心肌肥大的機(jī)制的初步研究53-55
• 4 討論55-58
• 5 其他工作58-62
• 5.1 構(gòu)建多種類型載體58-59
• 5.2 體外合成HFHG5的特異性探針和非特異性探針59
• 5.3 注射ISO和生理鹽水，，誘導(dǎo)Lrrc10、pygo1小鼠心臟肥厚59-60
• 5.4 熒光報(bào)告系統(tǒng)實(shí)驗(yàn)60
• 5.5 多種基因型小鼠的繁殖及鑒定60-62
• 結(jié)語(yǔ)62-64
• 參考文獻(xiàn)64-70
• 附錄70-73
• 致謝73-74

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