本文關(guān)鍵詞：SPIO與Fth1基因標(biāo)記MSCs體外分化為心肌細(xì)胞的MRI研究，由筆耕文化傳播整理發(fā)布。

【摘要】：目的本研究旨在評價(jià)鐵蛋白基因Fth1標(biāo)記大鼠骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞(MSCs)的可行性、有效性及安全性。觀察不同濃度的超順磁性氧化鐵(SPIO)及Fth1基因標(biāo)記對MSCs增殖活性的影響。探討SPIO及Fth1基因標(biāo)記兩種方法對MSCs定向分化心肌細(xì)胞分化能力的影響。體外研究SPIO及Fth1基因標(biāo)記MSCs定向分化心肌細(xì)胞的MRI表現(xiàn)及其差異。方法1.采用全骨髓貼壁法分離、培養(yǎng)SD大鼠MSCs,流式細(xì)胞儀檢測細(xì)胞表面抗原CD34、CD44及CD90,成骨及成脂肪誘導(dǎo)分化進(jìn)行鑒定。2.構(gòu)建攜帶鐵蛋白重鏈基因Fth1的慢病毒表達(dá)載體。Fth1報(bào)告基因慢病毒轉(zhuǎn)染MSCs熒光顯微鏡觀察增強(qiáng)型綠色熒光蛋白EGFP表達(dá),q RT-PCR、Western blot檢測Fth1基因及目的蛋白表達(dá)情況。3.將不同濃度(25μg/ml、50μg/ml、75μg/ml、100μg/ml)的超順磁性氧化鐵(SPIO)標(biāo)記MSCs;普魯士藍(lán)染色檢測SPIO標(biāo)記效率;CCK-8法檢測SPIO標(biāo)記MSCs的增殖活性。4.用不同濃度檸檬酸鐵培養(yǎng)液(0.1 mol/L、1 mol/L、3 mol/L、5 mol/L、7 mol/L)培養(yǎng)Fth1-MSCs,普魯士藍(lán)染色檢測細(xì)胞攝鐵情況,CCK-8法檢測Fth1-MSCs的增殖活性。5.將50μg/ml SPIO和Fth1標(biāo)記的MSCs體外經(jīng)10μmol/L 5-aza誘導(dǎo)向心肌細(xì)胞分化,誘導(dǎo)28天后病理染色檢測心肌特異性標(biāo)記物(α-肌動蛋白、心肌肌鈣蛋白T)的表達(dá)情況。在標(biāo)記后不同時(shí)間點(diǎn),對兩組MSCs定向分化的心肌細(xì)胞進(jìn)行MRI檢查,觀察其信號變化情況及兩組信號的差異性。結(jié)果1.全骨髓貼壁法提取的MSCs呈梭形、放射狀排列并貼壁生長,CD34、CD44及CD90陽性細(xì)胞率分別為2.8%,99.8%,99.5%,具有向骨細(xì)胞及脂肪細(xì)胞定向分化的能力。2.通過酶切PCR鑒定及重組載體基因測序驗(yàn)證,成功構(gòu)建攜帶鐵蛋白重鏈Fth1及熒光蛋白基因的過表達(dá)慢病毒載體p CDH-EGFP-Fth1。3.Fth1基因成功轉(zhuǎn)染MSCs,熒光顯微鏡下觀察約80%MSCs表達(dá)EGFP,qRT-PCR及Western blot檢測鐵蛋白重鏈基因及其目的蛋白表達(dá)量較普通MSCs明顯增加。4.與濃度25μg/ml、75μg/ml及100μg/ml的比較,濃度50μg/ml的SPIO對MSCs標(biāo)記效率高,可達(dá)98%,且對MSCs增殖活性影響較小,與濃度25μg/ml組比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P0.05),而濃度為75μg/ml及100μg/ml的SPIO雖然標(biāo)記效率高,但對MSCs增殖活性有明顯影響,與對照組、25μg/ml組及50μg/ml組比較差異有明顯統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P0.05)。5.未加入檸檬酸鐵培養(yǎng)液培養(yǎng),Fth1-MSCs增殖活性與對照組差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P0.05);加入Fe濃度為0.1 mol/L的含鐵培養(yǎng)液后,普魯士藍(lán)染色未觀察到藍(lán)色顆粒;加入Fe濃度為1 mol/L、3 mol/L、5 mol/L、7 mol/L條件培養(yǎng)基的Fth1-MSCs細(xì)胞質(zhì)內(nèi)均有藍(lán)色顆粒,并隨條件培養(yǎng)基鐵濃度增加而染色加深,但隨著濃度的增加,細(xì)胞的形態(tài)受到一定影響,且細(xì)胞增殖活性與對照組相比差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P0.05)。6.50μg/ml SPIO及Fth1標(biāo)記MSCs定向誘導(dǎo)分化后均能表達(dá)心肌細(xì)胞特異性標(biāo)記物(α-肌動蛋白、心肌肌鈣蛋白T)。隨著SPIO濃度升高,MRI的T2信號逐漸降低;SPIO標(biāo)記MSCs心肌細(xì)胞分化過程中隨時(shí)間延長信號逐漸降低,至28天時(shí)MRI T2信號無降低,與標(biāo)記前相同。Fth1-MSCs加入檸檬酸鐵培養(yǎng)液5天后MRI上T2信號降低,且隨時(shí)間延長信號無明顯變化,28天時(shí)MRI T2信號與5天、14天相比差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P0.05)。結(jié)論1.可成功構(gòu)建攜帶Fth1的慢病毒過表達(dá)載體,轉(zhuǎn)染后的Fth1-MSCs能穩(wěn)定、高效地表達(dá)Fth1,并不影響其增殖活性,但加入檸檬酸鐵培養(yǎng)基后對細(xì)胞增殖有一定影響。2.50μg/ml濃度的SPIO可高效標(biāo)記MSCs,MRI信號改變明顯,且對細(xì)胞增殖活性影響相對較小,為標(biāo)記MSCs的最適SPIO濃度。3.Fth1的慢病毒過表達(dá)載體轉(zhuǎn)染MSCs在未加入檸檬酸鐵培養(yǎng)液培養(yǎng)時(shí),對Fth1-MSCs增殖活性沒有影響,條件培養(yǎng)基鐵濃度越高,細(xì)胞攝入鐵也越多,但對細(xì)胞形態(tài)及增殖活性影響越大,因此選擇1 mol/L的檸檬酸鐵培養(yǎng)液較為適宜。4.50μg/ml濃度SPIO及Fth1報(bào)告基因標(biāo)記,均不影響MSCs向心肌細(xì)胞分化的能力。MR可檢測50μg/ml濃度SPIO及Fth1標(biāo)記MSCs心肌細(xì)胞分化過程的信號變化,50μg/ml標(biāo)記MSCs心肌細(xì)胞分化過程中低信號隨時(shí)間延長逐漸升高,至標(biāo)記后28天低信號基本消失,而心肌細(xì)胞分化中的Fth1-MSCs加入條件培養(yǎng)基后28天低信號沒有明顯改變,可進(jìn)行長期示蹤監(jiān)測。
【關(guān)鍵詞】：骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞 超順磁性氧化鐵 鐵蛋白報(bào)告基因 心肌細(xì)胞分化 MRI成像 生物學(xué)特性
【學(xué)位授予單位】：蚌埠醫(yī)學(xué)院
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2016
【分類號】：R54;R445.2
【目錄】：

• 中文摘要5-8
• ABSTRACT8-11
• 引言11-13
• 主要儀器與設(shè)備13-14
• 主要實(shí)驗(yàn)試劑14-15
• 1.材料與方法15-26
• 2.結(jié)果26-39
• 3.討論39-43
• 4.結(jié)論43-44
• 參考文獻(xiàn)44-47
• 致謝47-48
• 附錄A 主要試劑配制48-49
• 附錄B 干細(xì)胞移植治療急性心肌梗死 MRI 示蹤的研究進(jìn)展49-56
• 參考文獻(xiàn)54-56
• 附錄C 碩士期間發(fā)表的學(xué)術(shù)論文56

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本文編號：482445