本文關(guān)鍵詞：Zeste基因增強子同源物1,2介導(dǎo)miR-214抑制心肌纖維化的作用研究，由筆耕文化傳播整理發(fā)布。

【摘要】：目前,我國心血管疾病患病率呈快速增長趨勢,估計心血管病現(xiàn)患病人數(shù)為2.9億,其中心力衰竭450萬人。我國每年死于心血管病約350萬人,居各類疾病之首。作為心肌重構(gòu)的重要方面,心肌纖維化參與多種心臟疾病的發(fā)生發(fā)展過程。長期的心肌纖維化很容易引起心力衰竭、致死性心律失常以及心臟驟停等。研究表明,缺血再灌注損傷、壓力負荷、糖尿病等多種因素均能通過調(diào)節(jié)纖維化相關(guān)基因的表達,誘發(fā)心肌纖維化。心肌纖維化導(dǎo)致心臟僵硬度增加,心室順應(yīng)性降低,引起心功能不全,嚴重時甚至心衰。此外,心肌纖維化還能引起心肌細胞出現(xiàn)異常的電耦聯(lián)活動,誘發(fā)心肌組織缺血缺氧,甚至心肌細胞的壞死等,是多種心臟疾病的重要病理基礎(chǔ)。但是,心肌纖維化的發(fā)病機制復(fù)雜,人們對于心肌纖維化發(fā)生發(fā)展的確切分子和細胞信號轉(zhuǎn)導(dǎo)機制還不完全清楚,尚未找到有效的干預(yù)心肌纖維化的方法。因此,進一步深入探討心肌纖維化發(fā)生的分子機制,不僅有助于我們更好的了解疾病本身,也對心肌纖維化相關(guān)疾病的診斷、治療以及預(yù)后判斷等有重要意義。心肌纖維化是心臟受到刺激時,成纖維細胞增殖,向肌成纖維細胞表型轉(zhuǎn)化,膠原蛋白尤其是Ⅰ型和Ⅲ型膠原合成增加,降解減少,導(dǎo)致膠原比例失調(diào),排列紊亂,以及細胞外基質(zhì)蛋白大量沉積的過程。作為心肌纖維化主要的效應(yīng)細胞,肌成纖維細胞以表達α-SMA為主要標志,并分泌大量細胞因子、生長因子以及細胞外基質(zhì)蛋白等,在心肌纖維化過程中起著十分關(guān)鍵的作用。基于目前的研究,在整體水平上,一般認為心肌纖維化的發(fā)生與腎素-血管經(jīng)張素-醛固酮系統(tǒng)(RAAS)激活,血管內(nèi)皮功能障礙及其衍生因子的內(nèi)分泌失調(diào)(PCI2、ET-1等),氧化應(yīng)激(ROS)和炎癥,細胞內(nèi)Ca2+調(diào)節(jié)失衡,調(diào)控性細胞因子(TGF-β、CTGF、PDCG等)表達增加有密切關(guān)系。在細胞和分子水平上,心肌纖維化的過程是多種刺激信號通過其受體或應(yīng)力感受器,以及下游細胞內(nèi)相應(yīng)的信號通路傳遞至細胞核內(nèi),啟動纖維化相關(guān)基因(包括Col I,ColⅢ, α-SMA,CTGF,MMP,Fibronectin等)表達的過程。目前已報道的調(diào)控的心肌纖維化的主要信號通路包括：TGF-β/Smad通路;MAPK/p38通路;RhoA/心肌蛋白相關(guān)轉(zhuǎn)錄因子(MRTF)通路；瞬時受體電位陽離子通道蛋白C6(TRPC6)/鈣調(diào)神經(jīng)磷酸酶(Calcineurin)通路等。這些刺激因子和信號通路之間存在著錯綜復(fù)雜、相互影響的關(guān)系,共同調(diào)控著心肌纖維化的發(fā)生發(fā)展進程。微小RNA (microRNAs)是一類內(nèi)源性的單鏈非編碼微小RNA,一般由18～25個核苷酸組成,可通過降解靶基因mRNA或抑制其翻譯發(fā)揮生物學效應(yīng)。越來越多的證據(jù)表明,多種miRNAs,如miR-1,-21,-29,-34,-199,-208等參與了心肌纖維化的發(fā)生發(fā)展進程。其中一些發(fā)揮重要作用的miRNAs有可能成為治療心肌纖維化的新靶點�；趍iRNAs基因芯片和實時定量PCR驗證結(jié)果,我們選擇miR-214-3p作為研究對象。文獻報道,miR-214在缺血再灌注小鼠心臟中發(fā)揮了一定的心肌保護作用,而miR-214敲除小鼠出現(xiàn)更加嚴重的心肌纖維化和心功能障礙。但是目前關(guān)于miR-214-3p對心肌纖維化的作用及其分子機制尚未闡明。生物信息學分析結(jié)果提示,Zeste基因增強子同源物1,2(EZH1,EZH2)可能是miR-214-3p的靶基因。EZH1和EZH2是PcG蛋白復(fù)合體家族中多梳蛋白抑制復(fù)合體2(PRC2)的重要成員,具有組蛋白甲基化轉(zhuǎn)移酶活性,是重要的轉(zhuǎn)錄抑制因子。它們可使靶基因啟動子上組蛋白H3第27位賴氨酸三甲基化,促使染色質(zhì)凝結(jié)和基因沉默。目前對在心肌成纖維細胞中miR-214-3p是否調(diào)控EZH1和EZH2表達尚未見報道。本文將利用Ang-Ⅱ灌注小鼠誘導(dǎo)心肌纖維化動物模型、Ang-Ⅱ處理心肌成纖維細胞誘導(dǎo)心肌纖維化細胞模型,通過雙熒光報告基因?qū)嶒?mimics介導(dǎo)過表達miR-214-3p, siRNAs介導(dǎo)分別沉默EZH1和EZH2表達等方法,在整體和細胞水平上明確miR-214在心肌纖維化中的作用：研究niR-214-3p是否能在轉(zhuǎn)錄水平調(diào)控EZH1和EZH2表達；驗證上述靶基因是否介導(dǎo)了miR-214-3p對心肌纖維化的調(diào)控作用。本文將闡明心肌重構(gòu)中miR-214-3p調(diào)控心肌纖維化的分子機制,為基于miRNAs的心肌纖維化治療研究提供科學依據(jù)。第一章miR-214在小鼠纖維化心肌中的表達目的：建立小鼠心肌纖維化的動物模型,明確miR-214在發(fā)生重構(gòu)小鼠心肌組織中的表達情況。方法：1.選取SPF級體重約20～25 g的雄性C57/BL6小鼠為實驗對象,通過植入Ang-Ⅱ膠囊滲透泵(1.46 mg/kg/2w)建立心肌纖維化的動物模型。模型組和假手術(shù)組各8只；2.采用尾壓法檢測小鼠收縮壓,并測量心臟重量與脛骨長度,計算相應(yīng)比值；3.動物B超檢測小鼠心肌結(jié)構(gòu)與心功能相關(guān)指標；4.采用Masson三色染色對小鼠心肌組織進行膠原纖維的染色觀察；5. RT-qPCR和Western-Blot分別檢測小鼠心肌組織中纖維化相關(guān)基因(Collal,Co13al,a-SMA)的mRNA和蛋白表達水平；6.用miRNAs表達譜芯片檢測Ang-Ⅱ灌注小鼠心肌中miRNAs的表達譜,RT-qPCR驗證小鼠心肌中差異表達的miRNAs。結(jié)果：1.與生理鹽水(Saline)組相比,Ang-Ⅱ灌注組小鼠收縮壓明顯升高,心臟重量與脛骨長度比值(HW/TL)明顯高于對照組。2.動物心臟B超結(jié)果顯示,與saline組比較,Ang-Ⅱ灌注組小鼠室間隔和心室壁厚度增加,左室容積變小,而反映心功能的射血分數(shù)(EF)和左室短軸縮率(FS)均顯著增加。3.Masson三色染色的結(jié)果顯示,比較saline組,模型組小鼠心肌組織膠原含量增加,纖維化程度加劇。4. RT-qPCR和Western-Blot的結(jié)果顯示,模型組小鼠心肌中纖維化相關(guān)基因Collal, Co13al, a-SMA的mRNA和蛋白水平顯著上調(diào)。5. miRNAs表達譜芯片結(jié)果顯示,與Saline組相比,模型組小鼠心肌中miRNAs表達異常,經(jīng)RT-qPCR驗證,其中明顯下調(diào)的miRNAs有miR-1,-133b,-16,-214,而miR-21表達顯著上調(diào),以miR-214在Ang-Ⅱ灌注小鼠心肌組織中下調(diào)最為顯著。結(jié)論：1.與saline組相比,模型組小鼠心肌組織發(fā)生病理性心肌纖維化,說明我們通過Ang-Ⅱ灌注成功建立心肌纖維化動物模型。2.miR-214在Ang-Ⅱ灌注誘導(dǎo)的重構(gòu)小鼠心肌中表達顯著下調(diào)。第二章miR-214對小鼠心肌纖維化的影響目的：明確過表達miR-214對小鼠心肌纖維化的影響。方法：1.選取SPF級體重約20～25 g的雄性C57/BL6小鼠為實驗對象,通過植入Ang-Ⅱ膠囊滲透泵(1.46 mg/kg/2w)建立心肌纖維化的動物模型。模型組和Saline組分別尾靜脈注射20 nmol agomiR-214和agomiR-NC,每組各8只動物；2.測量心臟重量與脛骨長度,計算相應(yīng)比值；3.動物心臟B超檢測小鼠心肌結(jié)構(gòu)與心功能相關(guān)指標；4.采用Masson三色染色對小鼠心肌組織進行膠原纖維的染色觀察。5. Western-Blot檢測小鼠心肌組織中纖維化相關(guān)蛋白(Collal,Co13al,α-SMA)表達水平。結(jié)果：1.與Saline組相比,模型組小鼠心臟重量與脛骨長度比值(HW/TL)明顯增加。而與agomiR-NC組相比,agomiR-214組HW/TL值顯著降低。2.動物B超結(jié)果顯示,比較saline組,模型組小鼠室間隔和心室壁厚度增加,左室容積變小,而反映心功能的射血分數(shù)(EF)和左室短軸縮率(FS)均顯著增加。而與agomiR-NC組相比,尾靜脈注射agomiR-214顯著改善Ang-Ⅱ誘導(dǎo)的小鼠心肌重構(gòu)和心功能代償性增強效應(yīng)。3. Masson三色染色的結(jié)果顯示,比較saline組,模型組小鼠心肌組織膠原含量增加,纖維化程度加劇。與agomiR-NC組相比,agomiR-214組纖維化程度降低。4. Western-Blot結(jié)果顯示,比較saline組,模型組小鼠心肌組織中纖維化相關(guān)蛋白水平顯著增加。與agomiR-NC組相比,agomiR-214組纖維化相關(guān)蛋白表達降低。結(jié)論：過表達miR-214可減緩Ang-Ⅱ誘導(dǎo)的小鼠心肌組織膠原沉積和心肌重構(gòu),并恢復(fù)心臟功能。第三章miR-214對纖維化相關(guān)基因的調(diào)控作用及其靶基因鑒定目的：明確miR-214對心肌成纖維細胞中纖維化表型的影響；對miR-214進行靶基因鑒定,并明確上述靶基因是否介導(dǎo)了miR-214對心肌纖維化的調(diào)控作用。方法：1.原代分離培養(yǎng)4 w C57/BL6小鼠心肌成纖維細胞,并通過細胞免疫熒光法檢測P3代心肌成纖維細胞(CFs)中α-SMA的表達；2.免疫熒光法檢測心肌成纖維細胞中纖維化相關(guān)蛋白(Collal,Col3al,α-SMA)表達水平；3.利用pGL3-promoter熒光素酶載體構(gòu)建含miR-214結(jié)合位點的EZH1,EZH2基因3'UTR重組質(zhì)粒以及相應(yīng)的3'UTR結(jié)合位點突變的重組質(zhì)粒,分別與miR-214mimic共轉(zhuǎn)染HEK293T細胞,雙熒光素酶報告基因?qū)嶒炶b定EZH1和EZH2是否為miR-214的作用靶點；4.通過轉(zhuǎn)染miR-214 mimic在CFs中過表達miR-214,RT-q PCR和Western Blot檢測EZH1和EZH2的mRNA和蛋白表達水平；5.10-5M Ang-Ⅱ處理CFs 24h, Western Blot檢測EZH1、EZH2、纖維化相關(guān)基因(Col1a1,Col3a1,α-SMA)水平變化；6.分別將EZH1 siRNA、EZH2 siRNA和miR-214 mimic轉(zhuǎn)染CFs,RT-q PCR和Western Blot檢測EZH1、EZH2、纖維化相關(guān)基因(Col1a1,Col3al,α-SMA)以及PPARy的mRNA和蛋白表達水平；7.腺病毒介導(dǎo)在CFs中分別過表達EZH1和EZH2,Western Blot檢測EZH1、ZH2、纖維化相關(guān)基因(Collal,Col3a1,α-SMA)以及PPARy的表達水平變化；8. PPARy siRNA轉(zhuǎn)染CFs, Western Blot檢測纖維化相關(guān)基因(Collal, CoBa1,α-SMA)以及PPARy的表達水平變化。結(jié)果：1.P3.代心肌成纖維細胞中有特異的α-SMA表達,所培養(yǎng)心肌成纖維細胞的純度達95%以上。2.轉(zhuǎn)染miR-214 mimic后,心肌成纖維細胞中纖維化相關(guān)蛋白(Collal,Col3al)的表達顯著降低。3.雙熒光素酶報告基因?qū)嶒烇@示在miR-214 mimic作用下,與對照組相比,miR-214與EZH1、EZH2 3'-UTR的結(jié)合能力顯著增加,熒光素酶活性均顯著下降。而轉(zhuǎn)染誘導(dǎo)突變的重組質(zhì)粒則不能改變熒光素酶活性。4.心肌成纖維細胞中過表達miR-214后,EZH1和EZH2的mRNA和蛋白水平均一致性的顯著下調(diào)。5.EZH1和EZH2在Ang-Ⅱ誘導(dǎo)的心肌纖維化細胞模型中表達顯著上調(diào)。6.利用siRNAs沉默心肌成纖維細胞中EZH1和EZH2表達后,纖維化相關(guān)基因(Collal, Col3al,α-SMA)的mRNA和蛋白表達水平均被抑制,而PPARγ的表達顯著增加,這與在心肌成纖維細胞中過表達miR-214的作用相一致。7.在心肌成纖維細胞中過表達EZH1和EZH2后,纖維化相關(guān)基因(Collal,Col3al,α-SMA)的蛋白水平顯著增加,而PPARγ的表達顯著降低。8.沉默PPARγ表達后,心肌成纖維細胞中纖維化相關(guān)基因(Collal,Col3al,α-SMA)的蛋白水平顯著增加。結(jié)論：1.EZH1和EZH2是miR-214的作用靶基因。2.miR-214通過在轉(zhuǎn)錄水平抑制EZH1和EZH2,使PPARγ表達增加,進而降低心肌成纖維細胞中纖維化相關(guān)基因的表達。全文總結(jié)：miR-214在Ang-Ⅱ灌注誘導(dǎo)的小鼠心肌纖維化動物模型中表達下調(diào)。尾靜脈注射miR-214可減緩Ang-Ⅱ誘導(dǎo)的小鼠心肌組織膠原沉積和心肌重構(gòu),并恢復(fù)心臟功能。miR-214的抗心肌纖維化作用主要是通過在轉(zhuǎn)錄水平抑制小鼠心肌成纖維細胞中EZH1和EZH2表達,進而上調(diào)PPARγ表達,降低纖維化相關(guān)基因的表達。
【關(guān)鍵詞】：心肌纖維化 miR-214 Zeste基因增強子同源物 細胞外基質(zhì)蛋白
【學位授予單位】：南方醫(yī)科大學
【學位級別】：碩士
【學位授予年份】：2016
【分類號】：R542.23
【目錄】：

• 摘要3-9
• ABSTRACT9-19
• 前言19-29
• 第一章 miR-214在小鼠纖維化心肌中的表達29-46
• 1 材料29-30
• 2 方法30-40
• 3 結(jié)果40-45
• 4 小結(jié)45-46
• 第二章 過表達miR-214對小鼠心肌纖維化的影響46-52
• 1 材料46-47
• 2 方法47-48
• 3 結(jié)果48-51
• 4 小結(jié)51-52
• 第三章 miR-214對纖維化相關(guān)基因表達的影響及其靶基因鑒定52-77
• 1 材料52-54
• 2 方法54-66
• 3 結(jié)果66-75
• 4 小結(jié)75-77
• 討論77-80
• 全文總結(jié)80-82
• 參考文獻82-88
• 附錄88-91
• 1 本文使用的PCR引物序列88-89
• 2 縮略詞89-91
• 攻讀碩士學位期間成果91-92
• 致謝92-93

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