本文關(guān)鍵詞：硒對(duì)同型半胱氨酸誘導(dǎo)的人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞線粒體自噬損傷的抑制作用，，由筆耕文化傳播整理發(fā)布。

【摘要】：目的:當(dāng)前心血管疾病成為所有致死原因的首位,而心血管疾病的發(fā)生、發(fā)展與血管內(nèi)皮功能障礙密切相關(guān)。通過(guò)研究血管內(nèi)皮功能來(lái)揭示心血管疾病的發(fā)病機(jī)制已成為重要的研究方法。線粒體自噬是當(dāng)前研究熱點(diǎn),同型半胱氨酸(Hcy)已被證實(shí)是心血管疾病危險(xiǎn)因子,同型半胱氨酸能否誘導(dǎo)內(nèi)皮細(xì)胞線粒體自噬值得探索。現(xiàn)在研究發(fā)現(xiàn)高同型半胱氨酸血癥(HHcy)患者常伴隨高銅(Cu)血癥,因此Hcy和Cu的聯(lián)合作用對(duì)內(nèi)皮細(xì)胞的影響值得探索。然而目前很多實(shí)驗(yàn)室所用血管內(nèi)皮細(xì)胞傳代過(guò)多、分化嚴(yán)重,對(duì)實(shí)驗(yàn)結(jié)果的說(shuō)服性造成影響。本實(shí)驗(yàn)通過(guò)提取原代人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞,初步探索同型半胱氨酸聯(lián)合銅損傷血管內(nèi)皮細(xì)胞線的機(jī)制,是否有粒體自噬參與,自噬是有利還是有害,而硒對(duì)可能發(fā)生的作用的干預(yù)作用。方法:(1)提取原代人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞。從新生兒臍帶提取臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞。(2)采用MTT法,檢測(cè)不同濃度的Hcy、Cu、Se、Hcy+Cu及Hcy+Cu+Se對(duì)細(xì)胞增殖的影響。以硫酸銅溶液及亞硒酸鈉溶液為銅離子及Se的來(lái)源,實(shí)驗(yàn)分為:(1)單純Hcy對(duì)細(xì)胞增殖的影響,Hcy濃度分別為10μM、20μM、40μM、100μM、200μM;(2)單純銅及單純硒對(duì)細(xì)胞增殖的影響,Cu濃度分別為10μM、20μM、30μM、40μM、50μMμM;Se濃度分別為0.4μM、1μM、2μM、5μM、10μM;(3)加銅是否加重Hcy抑制增殖作用,各組合濃度為Hcy 40μM+Cu 10μM、Hcy 40μM+Cu 20μM、Hcy 40μM+Cu 30μM、Hcy 40μM+Cu40μM、Hcy40μM+Cu50μM;Hcy及Cu的處理時(shí)間均為48小時(shí)。(3)采用MTT法探索最適Se濃度。通過(guò)方法(2)中我們發(fā)現(xiàn)Hcy從40μM開始對(duì)細(xì)胞增殖產(chǎn)生了明顯抑制,在該實(shí)驗(yàn)Cu及Se的限定濃度范圍內(nèi),單純加銅或單純加硒對(duì)細(xì)胞增殖無(wú)明顯影響,而在Hcy濃度為40μM時(shí),加不同濃度的Cu加重了對(duì)細(xì)胞增殖的抑制作用。本實(shí)驗(yàn)選取Hcy 40μM+Cu 40μM作為人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞損傷模型,通過(guò)加不同濃度硒來(lái)探討硒的作用。實(shí)驗(yàn)分為正常對(duì)照組、Hcy 40μM+Cu 40μM+Se 0.4μM組、Hcy 40μM+Cu 40μM+Se 1μM組、Hcy 40μM+Cu 40μM+Se2μM組、Hcy 40μM+Cu 40μM+Se 5μM組、Hcy 40μM+Cu 40μM+Se 10μM組。處理方法同(2)中。(4)細(xì)胞流式技術(shù)檢測(cè)Hcy+Cu、Hcy+Cu+Se處理組ROS含量,探討Se對(duì)ROS生成量的影響。采用DCFH-DA熒光探針、流式細(xì)胞儀技術(shù)檢測(cè)活性氧。分為正常對(duì)照組、Hcy 40μM+Cu 40μM組、Hcy 40μM+Cu 40μM+Se 2μM組。(5)細(xì)胞流式技術(shù)檢測(cè)Hcy+Cu、Hcy+Cu+Se處理組線粒體膜電位采用JC-1染料利用細(xì)胞流式技術(shù)檢測(cè)線粒體膜電位,實(shí)驗(yàn)分為正常對(duì)照組、Hcy 40μM+Cu 40μM組、Hcy 40μM+Cu 40μM+Se 2μM組。(6)細(xì)胞流式技術(shù)檢測(cè)Hcy+Cu、Hcy+Cu+Se處理組細(xì)胞凋亡率采用Annexin V法檢測(cè)細(xì)胞凋亡率,實(shí)驗(yàn)分為正常對(duì)照組、Hcy 40μM+Cu 40μM組、Hcy 40μM+Cu 40μM+Se 2μM組。(7)蛋白免疫印跡法檢測(cè)LC3、PINK1蛋白表達(dá)量,探討Hcy+Cu加重人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞線粒體自噬的可能,以及Se的干預(yù)作用。實(shí)驗(yàn)分為正常對(duì)照組、Hcy 40μM+Cu 40μM組、Hcy 40μM+Cu 40μM+Se2μM組,Western-blot檢測(cè)LC3級(jí)PINK1蛋白表達(dá),探討Hcu+Cu能否導(dǎo)致細(xì)胞自噬加重。結(jié)果:(1)成功提取原代人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞。(2)40μM及以上的Hcy抑制細(xì)胞增殖,P0.05,且隨Hcy濃度增加抑制作用提高,P0.05。Hcy和Cu的聯(lián)合作用能加重細(xì)胞增殖的抑制作用。(3)0.4μM到5μM的Se對(duì)Hcy+Cu所致細(xì)胞增殖抑制具有減輕作用,P0.05;且硒的濃度為2μM時(shí)減輕抑制作用最明顯,P0.05。(4)Hcy+Cu+Se組ROS含量較Hcy+Cu組低(P0.05),但較ctrl組高(P0.05)。(5)Hcy+Cu+Se組膜電位較Hcy+Cu組高(P0.05),但較ctrl組低(P0.05)。(6)Hcy+Cu+Se組凋亡率較Hcy+Cu組低(P0.05),但較ctrl組高(P0.05)。(7)Hcy+Cu+Se組LC3II/LC3I灰度值較Hcy+Cu組低(P0.05),但較ctrl組高(P0.05);Hcy+Cu+Se組PINK1灰度值較Hcy+Cu組低(P0.05),但較ctrl組高(P0.05)。結(jié)論:(1)同型半胱氨酸從40μM濃度開始能抑制人臍靜脈內(nèi)皮增殖,同型半胱氨酸濃度越高,細(xì)胞增殖抑制越顯著;(2)Cu加重了同型半胱氨酸抑制人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞增殖;(3)硒能減輕Cu和同型半胱氨酸對(duì)人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞增殖的影響,且較適合人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞的硒濃度是2μM;(4)Cu和同型半胱氨酸損傷內(nèi)皮細(xì)胞機(jī)制有線粒體自噬的參與,該自噬作用可能是過(guò)度而有害的,而硒可以減輕這一作用;(5)Cu和同型半胱氨酸可能通過(guò)增加細(xì)胞內(nèi)ROS而經(jīng)PINK1/Parkin途徑介導(dǎo)了線粒體自噬過(guò)度的損害,而硒可能通過(guò)減少ROS的生成抑制了線粒體自噬過(guò)度。
【關(guān)鍵詞】：硒 同型半胱氨酸 氧化應(yīng)激 線粒體自噬
【學(xué)位授予單位】：南昌大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2016
【分類號(hào)】：R54
【目錄】：

• 摘要3-6
• ABSTRACT6-12
• 中英文縮略詞12-13
• 第1章 前言13-16
• 第2章 實(shí)驗(yàn)材料和方法16-30
• 2.1 實(shí)驗(yàn)材料16-18
• 2.1.1 實(shí)驗(yàn)細(xì)胞來(lái)源16
• 2.1.2 主要實(shí)驗(yàn)試劑和藥品16-17
• 2.1.3 主要儀器17-18
• 2.2 實(shí)驗(yàn)方法18-29
• 2.2.1 相關(guān)溶液的配制18-21
• 2.2.2 原代人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞提取過(guò)程及傳代過(guò)程21-22
• 2.2.3 MTT法測(cè)細(xì)胞增值率22-24
• 2.2.4 細(xì)胞流式技術(shù)檢測(cè)不同處理組活性氧ROS含量24
• 2.2.5 流式細(xì)胞儀JC-1 法線粒體膜電位的檢測(cè)24-25
• 2.2.6 流式細(xì)胞儀Annexin V法檢測(cè)細(xì)胞凋亡率25
• 2.2.7 Western-blot檢測(cè)LC3、PINK1蛋白表達(dá)量25-29
• 2.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理29-30
• 第3章 結(jié)果30-39
• 3.1 成功提取原代人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞30
• 3.2 MTT法測(cè)細(xì)胞增值率30-33
• 3.2.1 Hcy、Hcy+Cu對(duì)人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞增殖的影響，以及Se對(duì)此的干預(yù)30-33
• 3.2.2 Se對(duì)Hcy+Cu所致細(xì)胞增值率下降的保護(hù)以及最適硒濃度33
• 3.3 不同處理組活性氧ROS含量33-35
• 3.4 不同處理組線粒體膜電位35-36
• 3.5 不同處理組細(xì)胞凋亡檢測(cè)結(jié)果36-37
• 3.6 Western-blot檢測(cè)LC3、PINK1蛋白表達(dá)量結(jié)果37-39
• 第4章 討論39-44
• 第5章 結(jié)論與展望44-45
• 5.1 結(jié)論44
• 5.2 進(jìn)一步研究方向44-45
• 致謝45-46
• 參考文獻(xiàn)46-51
• 綜述 硒與心血管系統(tǒng)疾病51-58
• 參考文獻(xiàn)56-58

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本文編號(hào)：423752