本文關(guān)鍵詞：人心臟干細(xì)胞定向分化為心肌細(xì)胞的研究，由筆耕文化傳播整理發(fā)布。

【摘要】：研究背景 心肌梗死(MI)是引起缺血性心肌病(ICM)導(dǎo)致心力衰竭(HF)的主要病因之一。目前臨床上的治療主要包括藥物、介入、外科手術(shù)治療。藥物治療可以改善癥狀并降低冠心病風(fēng)險(xiǎn)；早期介入治療可以開(kāi)通閉塞血管降低心肌梗死的死亡率；外科冠脈搭橋治療可以改善閉塞血管遠(yuǎn)端心肌細(xì)胞的血液供應(yīng)，改善癥狀。心臟移植治療可從根本上達(dá)到治療的目的，但存在免疫排除反應(yīng)、供體數(shù)量有限，費(fèi)用昂貴等問(wèn)題。然而對(duì)于心肌缺血梗死后細(xì)胞喪失的問(wèn)題，目前常用的臨床治療方法均無(wú)法解決，不能達(dá)到心臟細(xì)胞水平重建的要求。心臟干細(xì)胞（Cardiac Stem Cells，CSCs）具有自我復(fù)制、克隆形成、多向分化潛能，具有定向分化為心臟細(xì)胞系趨勢(shì)，而自體心臟干細(xì)胞移植治療不存在倫理問(wèn)題、無(wú)免疫排斥反應(yīng)，是治療心肌梗死及缺血性心肌病理想的種子細(xì)胞。目前國(guó)內(nèi)外關(guān)于心臟干細(xì)胞向心肌細(xì)胞誘導(dǎo)分化的研究較多，但大多數(shù)為動(dòng)物實(shí)驗(yàn)，且由于實(shí)驗(yàn)方法不同誘導(dǎo)分化的效率也頗有差異。人心臟干細(xì)胞因其獨(dú)特的性能，，具有更廣泛的臨床應(yīng)用潛能，有望成為一種優(yōu)質(zhì)高效治療心血管疾病的種子細(xì)胞。 研究目的 1.研究人心臟干細(xì)胞體外分離、培養(yǎng)及生物學(xué)特征。 2.探索人心臟干細(xì)胞的純化與鑒定方法。 3.探索5-AZA和Ang II及聯(lián)合誘導(dǎo)人心臟干細(xì)胞向心肌細(xì)胞分化及提高分化率的方法。 研究方法 1.經(jīng)患者或家屬同意并簽署知情同意書(shū)后從心外科手術(shù)中獲取人心臟右心耳組織,經(jīng)Ⅱ型膠原酶消化、接種培養(yǎng),待其融合達(dá)90%左右后進(jìn)行傳代，選P2～P4細(xì)胞用流式細(xì)胞儀對(duì)其進(jìn)行表面標(biāo)志物CD117（c-kit）、CD31、CD45檢測(cè)。 2. P2～P8細(xì)胞與免疫熒光（PE）標(biāo)記的心臟干細(xì)胞抗體CD117（c-kit）結(jié)合后經(jīng)流式細(xì)胞儀無(wú)菌分選純化心臟干細(xì)胞，對(duì)無(wú)菌分選純化后的c-kit+CSCs進(jìn)行培養(yǎng)、細(xì)胞形態(tài)學(xué)觀察及免疫熒光染色鑒定。 3.選取無(wú)菌分選純化后細(xì)胞融合90%左右的c-kit+CSCs進(jìn)行誘導(dǎo)、分化實(shí)驗(yàn)。實(shí)驗(yàn)隨機(jī)分為4組：①空白對(duì)照組（Control組普通細(xì)胞培養(yǎng)液）、②5-AZA誘導(dǎo)組（10μmol/L）、③Ang II誘導(dǎo)組（0.1μmol/L）、④5-AZA和Ang II聯(lián)合誘導(dǎo)組（10μmol/L+0.1μmol/L）�？瞻讓�(duì)照組更換普通細(xì)胞培養(yǎng)液培養(yǎng)；5-AZA、Ang II單獨(dú)誘導(dǎo)組誘導(dǎo)24h后棄去誘導(dǎo)培養(yǎng)液，PBS洗滌2次，更換普通細(xì)胞培養(yǎng)液培養(yǎng)；5-AZA和Ang II聯(lián)合誘導(dǎo)組24h后棄去5-AZA誘導(dǎo)培養(yǎng)液，PBS洗滌2次，更換Ang II誘導(dǎo)培養(yǎng)液，24h后PBS洗滌2次，更換普細(xì)胞培養(yǎng)液繼續(xù)培養(yǎng)。分別在96h、4W觀察細(xì)胞形態(tài)變化；4W后用免疫熒光染色、Western Blotting測(cè)定心肌細(xì)胞特異性蛋白cTn I、Cx43的表達(dá)；用流式細(xì)胞儀測(cè)定各組心肌細(xì)胞分化率。 研究結(jié)果 1.原代細(xì)胞形態(tài)學(xué)特征：倒置相差顯微鏡下觀察，細(xì)胞10d左右貼壁，貼壁細(xì)胞大小不一，呈三角形、梭形、多角形。貼壁1W后細(xì)胞快速增殖，向四周呈集落樣生長(zhǎng)，20d左右融合達(dá)到80%。 2.細(xì)胞表面標(biāo)志物流式細(xì)胞儀檢測(cè)：用流式細(xì)胞儀對(duì)細(xì)胞表面CD117、CD31、CD45標(biāo)志物檢測(cè)，統(tǒng)計(jì)結(jié)果顯示：CD117陽(yáng)性表達(dá)率為(26.4±7.52)%、CD31陽(yáng)性表達(dá)率為(8.5±3.81)%、CD45陽(yáng)性表達(dá)率為(1.85±0.51)%。 3.人心臟干細(xì)胞純化及免疫熒光染色鑒定：流式細(xì)胞儀無(wú)菌分選獲得純度約為98.5%的c-kit+CSCs。倒置相差顯微鏡下觀察純化的c-kit+CSCs，細(xì)胞24h內(nèi)均勻貼壁，細(xì)胞體積較原代細(xì)胞小，形態(tài)相似，呈長(zhǎng)梭形或短梭形，折光性強(qiáng)，經(jīng)7d左右停滯期后細(xì)胞快速擴(kuò)增，14d左右融合達(dá)80%。免疫熒光顯微鏡下觀察幾乎所有細(xì)胞有都表達(dá)紅色熒光（PE-CD117），細(xì)胞呈長(zhǎng)梭形或短梭形，細(xì)胞核圓、居中。 4.人心臟干細(xì)胞誘導(dǎo)后細(xì)胞形態(tài)學(xué)特征：誘導(dǎo)96h后，Control組細(xì)胞形態(tài)沒(méi)有明顯改變，排列無(wú)規(guī)律性；5-AZA組細(xì)胞死亡脫落明顯，細(xì)胞近似梭形，以簇狀排列為主；Ang II組細(xì)胞近似梭形，以條梭狀排列為主；Ang II和5-AZA聯(lián)合組細(xì)胞少量死亡脫落，細(xì)胞近似梭形，排列呈以簇狀或條索狀。4W后Control組：細(xì)胞體積大小不均一，呈長(zhǎng)梭狀或短梭狀、多角形等，少數(shù)細(xì)胞形態(tài)較誘導(dǎo)前變長(zhǎng)，無(wú)明顯排列規(guī)律；各誘導(dǎo)組細(xì)胞形態(tài)均變長(zhǎng)，以梭形細(xì)胞為主，排列呈束狀，5-AZA和Ang II聯(lián)合組細(xì)胞形態(tài)、排列變化最為顯著。 5.人心臟干細(xì)胞誘導(dǎo)后心肌細(xì)胞特異性蛋白cTn I、Cx43測(cè)定：誘導(dǎo)4W后免疫熒光、Western blotting結(jié)果顯示，四組細(xì)胞中均有cTn I、Cx43表達(dá)，Control組表達(dá)最弱，5-AZA和Ang II聯(lián)合組表達(dá)最強(qiáng)。統(tǒng)計(jì)結(jié)果顯示：5-AZA組、5-AZA和Ang II聯(lián)合組表達(dá)高于Control組，有顯著統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（P 0.01）；5-AZA和Ang II聯(lián)合組表達(dá)高于Ang II組，有顯著統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（P 0.01）；5-AZA和Ang II聯(lián)合組表達(dá)高于5-AZA組，有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（P 0.05）；5-AZA組表達(dá)高于Ang II組，有計(jì)學(xué)差異（P 0.05）；Ang II組高于Control組，有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（P 0.05）。 6.人心臟干細(xì)胞誘導(dǎo)后心肌細(xì)胞分化率測(cè)定：誘導(dǎo)4W后流式細(xì)胞儀分析各組心肌細(xì)胞分化率，統(tǒng)計(jì)結(jié)果顯示：Control組（28.86±4.62)%、5-AZA組(53.71±7.5)%、Ang II組(41.48±7.12)%、5-AZA和Ang II聯(lián)合組(65.74±6.21)%；四組間見(jiàn)均有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（P 0.05）；5-AZA組、5-AZA和Ang II聯(lián)合組高于Control組，有顯著統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（P 0.01）。 研究結(jié)論 1.采用酶消化法可以從人右心耳組織中分離培養(yǎng)出人心臟干細(xì)胞。 2.通過(guò)流式細(xì)胞儀無(wú)菌分選純化獲得高純度的c-kit+CSCs，人c-kit+CSCs在心臟干細(xì)胞培養(yǎng)液中可以快速生長(zhǎng)增殖。 3.人c-kit+CSCs能夠在普通細(xì)胞培養(yǎng)液中向心肌細(xì)胞分化，具有自我分化可能性，但速度較慢。 4.5-AZA、Ang II均能誘導(dǎo)人c-kit+CSCs向心肌細(xì)胞分化，5-AZA和Ang II聯(lián)合誘導(dǎo)的心肌細(xì)胞分化率高于5-AZA、Ang II單純誘導(dǎo)方案，分化率可達(dá)(65.74±6.21)%。
【關(guān)鍵詞】：人心臟干細(xì)胞 5-氮雜胞苷 血管緊張素II 分化 心肌細(xì)胞
【學(xué)位授予單位】：第四軍醫(yī)大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2013
【分類(lèi)號(hào)】：R542.22
【目錄】：

• 縮略語(yǔ)表5-8
• 中文摘要8-11
• 英文摘要11-15
• 前言15-16
• 文獻(xiàn)回顧16-23
• 實(shí)驗(yàn)一 人心臟干細(xì)胞體外分離、培養(yǎng)及生物學(xué)特征23-30
• 引言23
• 1 材料23-24
• 2 方法24-26
• 3 結(jié)果26-27
• 4 討論27-30
• 實(shí)驗(yàn)二 人心臟干細(xì)胞純化及鑒定30-36
• 引言30
• 1 材料30-31
• 2 方法31-32
• 3 結(jié)果32-34
• 4 討論34-36
• 實(shí)驗(yàn)三 5-AZA 和 AngII 及聯(lián)合誘導(dǎo)人心臟干細(xì)胞向心肌細(xì)胞分化的研究36-51
• 引言36-37
• 1 材料37-38
• 2 方法38-43
• 3 結(jié)果43-49
• 4 討論49-51
• 小結(jié)51-52
• 參考文獻(xiàn)52-66
• 個(gè)人簡(jiǎn)歷和研究成果66-68
• 致謝68

【參考文獻(xiàn)】

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  本文關(guān)鍵詞：人心臟干細(xì)胞定向分化為心肌細(xì)胞的研究，由筆耕文化傳播整理發(fā)布。

本文編號(hào)：412226