肺動脈高壓(pulmonary arterial hypertension,PAH)是嚴(yán)重危害人類健康易致死亡的心肺血管疾病,如果未及時診斷和積極治療,患者早期中位生存期不超過3年。PAH主要特征為肺血管功能和結(jié)構(gòu)發(fā)生進(jìn)行性改變,可導(dǎo)致右心衰竭而死亡。低氧是誘發(fā)和加重PAH的常見致病因素之一,它能夠?qū)е路窝軆?nèi)環(huán)境紊亂,發(fā)生嚴(yán)重的血管功能與結(jié)構(gòu)的改變。在肺動脈血管重構(gòu)過程中,PASMC(pulmonary artery smooth muscle cell,PASMC)的表型轉(zhuǎn)換、增殖、遷移和凋亡失衡是PAH發(fā)生發(fā)展的重要環(huán)節(jié)。作為典型的PAH保護(hù)性信號通路,BMP-Smadl/5-PPARγ的激活可以對抗PAH致病信號通路TGF-β-Smad3,發(fā)揮重要的血管保護(hù)作用。同時越來越多的研究證明血管保護(hù)因子的泛素化和去泛素化調(diào)控在PAH中也發(fā)揮著重要的作用。我們近來研究,腺苷酸激活蛋白激酶(AMP-activated protein kinase,AMPK)磷酸化血管緊張素轉(zhuǎn)化酶2(Angiotensin-converting enzyme 2,ACE2)能夠有效地抑制其泛素化降解而發(fā)揮...

【文章頁數(shù)】：150 頁

【學(xué)位級別】：博士

【文章目錄】：
摘要
Abstract
符號說明
前言
第1章 MDM2調(diào)控ACE2泛素化參與PAH的病理過程
    1.1 實驗材料
        1.1.1 實驗動物、細(xì)胞
        1.1.2 實驗設(shè)備
        1.1.3 主要實驗試劑與抗體
        1.1.4 實驗試劑配制
    1.2 實驗方法
        1.2.1 臨床患者肺組織標(biāo)本
        1.2.2 HEK293細(xì)胞培養(yǎng)和siRNA轉(zhuǎn)染
        1.2.3 免疫共沉淀(CO-IP)
        1.2.4 實驗動物分組
        1.2.5 小鼠血流動力學(xué)檢測步驟
        1.2.6 右心室肥厚指標(biāo)評估
        1.2.7 肺組織與右心室取材與存放
        1.2.8 蘇木素-伊紅染色步驟
        1.2.9 肺組織蛋白提取步驟
        1.2.10 肺組織蛋白定量步驟
        1.2.11 Western Blot步驟
        1.2.12 Angiogram步驟
        1.2.13 統(tǒng)計方法
    1.3 實驗結(jié)果
        1.3.1 UbiBrowser預(yù)測PPARγ和ACE2的E3泛素連接酶及BMPRII突變的家族性PAH大數(shù)據(jù)分析
        1.3.2 臨床患者和實驗性小鼠PAH肺組織標(biāo)本中MDM2和ACE2蛋白表達(dá)水平檢測及MDM2對ACE2穩(wěn)定性調(diào)控
        1.3.3 E3泛素連接酶MDM2調(diào)控ACE2在低氧下的泛素化降解
        1.3.4 MDM2抑制劑JNJ-165改善小鼠PAH及血管重構(gòu)病理改變
    1.4 討論
第2章 BRCC36對慢性缺氧誘導(dǎo)的PAH及肺血管重構(gòu)的作用及機制
    2.1 實驗材料
        2.1.1 實驗動物、細(xì)胞、重組腺病毒
        2.1.2 實驗設(shè)備
        2.1.3 主要實驗試劑與抗體
        2.1.4 實驗試劑配制
    2.2 實驗方法
        2.2.1 實驗動物分組及流程示意圖
        2.2.2 PAH缺氧模型建立
        2.2.3 小鼠基因組DNA提取
        2.2.4 SMA22α-BRCC36過表達(dá)轉(zhuǎn)基因小鼠的鑒定
        2.2.5 小鼠血流動力學(xué)檢測步驟
        2.2.6 右心室肥厚指標(biāo)評估
        2.2.7 肺組織與右心室取材與存放
        2.2.8 肺組織石蠟切片制作步驟
        2.2.9 蘇木素-伊紅染色步驟
        2.2.10 Weigert彈力纖維染色步驟
        2.2.11 免疫組織化學(xué)染色步驟
        2.2.12 TUNEL細(xì)胞凋亡檢測步驟(顯色法)
        2.2.13 肺組織蛋白提取步驟
        2.2.14 肺組織蛋白定量步驟
        2.2.15 Western Blot步驟
        2.2.16 臨床患者肺組織標(biāo)本
        2.2.17 臨床人肺動脈平滑肌細(xì)胞獲取與培養(yǎng)
        2.2.18 大鼠PASMC原代培養(yǎng)
        2.2.19 PASMC傳代步驟
        2.2.20 PASMC鑒定
        2.2.21 CCK-8法檢測PASMC的增殖活力實驗
        2.2.22 TUNEL細(xì)胞凋亡檢測(熒光法)
        2.2.23 Transwell遷移小室檢測細(xì)胞遷移實驗步驟
        2.2.24 293A細(xì)胞復(fù)蘇、傳代、凍存步驟
        2.2.25 重組腺病毒擴增及收集
        2.2.26 細(xì)胞蛋白提取步驟
        2.2.27 細(xì)胞蛋白定量步驟
        2.2.28 細(xì)胞總RNA提取步驟
        2.2.29 cDNA反轉(zhuǎn)錄合成步驟
        2.2.30 RT-PCR步驟
        2.2.31 統(tǒng)計方法
    2.3 實驗結(jié)果
        2.3.1 缺氧對C57BL/6野生型小鼠右心室壓力和肺動脈病理性重構(gòu)的影響
        2.3.2 缺氧處理對野生小鼠肺組織中BRCC36等細(xì)胞因子表達(dá)水平的影響
        2.3.3 臨床PAH患者肺組織標(biāo)本及離體培養(yǎng)的PASMC中BRCC36細(xì)胞因子表達(dá)水平檢測
        2.3.4 SMA22α-BRCC36特異性過表達(dá)小鼠鑒定結(jié)果
        2.3.5 平滑肌細(xì)胞特異性過表達(dá)BRCC36對慢性缺氧小鼠PAH及肺動脈病理性重構(gòu)的影響
        2.3.6 過表達(dá)BRCC36對BMP/TGF-β-PPARγ信號通路的影響
        2.3.7 大鼠PASMC原代培養(yǎng)及鑒定
        2.3.8 探討缺氧干預(yù)對PASMC內(nèi)BMP-Smad1/5及PPARγ的調(diào)節(jié)效應(yīng)及對BRCC表達(dá)的影響
        2.3.9 探討B(tài)MP-PPARγ-apoE通路的活化對BRCC36表達(dá)的調(diào)節(jié)效應(yīng)
        2.3.10 BRCC36重組腺病毒感染PASMC效果
        2.3.11 探討B(tài)RCC36對PASMC缺氧條件下BMP-PPA:Rγ-apoE軸的調(diào)節(jié)效應(yīng)
        2.3.12 探討B(tài)RCC36對PASMC缺氧條件下TGF-β-Smad3-PPARγ信號通路的影響
    2.4 討論
第3章 PAE對PAH及肺血管重構(gòu)的療效及對BRCC36表達(dá)水平的影響
    3.1 實驗材料
        3.1.1 實驗動物的來源
        3.1.2 實驗設(shè)備
        3.1.3 主要實驗試劑與抗體
        3.1.4 實驗試劑配制
    3.2 實驗方法
        3.2.1 PAE溶液配制
        3.2.2 實驗動物分組
        3.2.3 PAH缺氧模型建立
        3.2.4 右心室測壓檢測步驟
        3.2.5 右心室肥厚指標(biāo)評估
        3.2.6 肺組織與右心室取材與存放
        3.2.7 肺組織右心室石蠟切片制作步驟
        3.2.8 蘇木素-伊紅染色步驟
        3.2.9 彈力纖維染色步驟
        3.2.10 免疫組織化學(xué)染色步驟
        3.2.11 TUNEL細(xì)胞凋亡檢測步驟
        3.2.12 肺組織蛋白提取步驟
        3.2.13 肺組織蛋白定量步驟
        3.2.14 Western Blot操作步驟
        3.2.15 統(tǒng)計方法
    3.3 實驗結(jié)果
        3.3.1 PAE可改善慢性缺氧所誘導(dǎo)的右心室壓力增加和右心室肥厚
        3.3.2 PAE可改善慢性缺氧誘導(dǎo)的肺血管重構(gòu)
        3.3.3 PAE可改善慢性缺氧誘導(dǎo)肺血管肌化、增殖和凋亡的影響
        3.3.4 PAE對低氧誘導(dǎo)的BMP-PPARγ-id1信號通路下調(diào)的影響
        3.3.5 PAE可抑制慢性缺氧誘導(dǎo)的TGF-β1-Smad3的激活
        3.3.6 PAE可誘導(dǎo)去泛素化酶BRCC36在肺組織中的表達(dá)
    3.4 討論
結(jié)語
參考文獻(xiàn)
附錄
    參考文獻(xiàn)
攻讀學(xué)位期間取得的研究成果
致謝



本文編號：3861298