發(fā)布時(shí)間：2023-03-23 23:47

　　引言:肺動脈高壓(PAH)是一種致命性心血管疾病,發(fā)病率和死亡率都很高,僅次于高血壓和冠脈綜合征,素有“心血管系統(tǒng)的惡性腫瘤”之稱。血小板衍生生長因子BB(PDGFBB)是血管平滑肌細(xì)胞最強(qiáng)的致有絲分裂原和趨化因子。microRNA(miRNA)是一類小分子非編碼RNA。在哺乳類動物細(xì)胞,miRNA主要是通過與靶基因mRNA 3’端非翻譯區(qū)(3’-UTR)特異結(jié)合,使靶基因mRNA降解或翻譯受阻,從而在轉(zhuǎn)錄后水平調(diào)控靶基因的表達(dá)。體內(nèi)miRNA的異常表達(dá)與多種疾病的發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)。為了探討與PAH相關(guān)的miRNA,本課題組在肺動脈平滑肌細(xì)胞(PASMC)鑒定了受PDGFBB調(diào)控的miRNA,其中包括下調(diào)最明顯的mi R-1281�；蚪M結(jié)構(gòu)分析發(fā)現(xiàn),pre-miR-1281與其下游基因E1A結(jié)合蛋白p300(EP300)可能來自于同一個(gè)轉(zhuǎn)錄本。PDGFBB也能顯著下調(diào)EP300的表達(dá)。EP300是具有抑癌作用的組蛋白乙�；D(zhuǎn)移酶,目前在腫瘤方面的研究報(bào)道較多,但在肺高壓方面尚未見任何報(bào)道。目的:研究PDGFBB下調(diào)miR-1281/EP300表達(dá)在PASMC異常增殖和遷移過程中的功能...

【文章頁數(shù)】：74 頁

【學(xué)位級別】：碩士

【文章目錄】：
摘要
Abstract
第1章 前言
    1.1 肺動脈高壓概述
    1.2 PDGF在肺動脈高壓中的概述
    1.3 miRNA的研究概述
    1.4 miRNA在肺動脈高壓中的調(diào)控作用
    1.5 組蛋白乙�；诜蝿用}高壓中的研究進(jìn)展
    1.6 EP300在細(xì)胞中的研究進(jìn)展
    1.7 本課題研究目的、內(nèi)容與意義
第2章 實(shí)驗(yàn)材料和方法
    2.1 實(shí)驗(yàn)材料
        2.1.1 分子克隆相關(guān)試劑
        2.1.2 細(xì)胞培養(yǎng)相關(guān)試劑
        2.1.3 藥物和轉(zhuǎn)染試劑
        2.1.4 熒光定量PCR相關(guān)試劑
        2.1.5 westernblots相關(guān)試劑
        2.1.6 動物實(shí)驗(yàn)相關(guān)試劑
        2.1.7 其他試劑
        2.1.8 分子生物學(xué)相關(guān)軟件
    2.2 儀器與耗材
        2.2.1 細(xì)胞系
        2.2.2 動物
        2.2.3 細(xì)胞培養(yǎng)相關(guān)儀器
        2.2.4 細(xì)菌實(shí)驗(yàn)相關(guān)儀器
        2.2.5 離心機(jī)
        2.2.6 PCR相關(guān)儀器
        2.2.7 DNA/RNA濃度測量儀器
        2.2.8 核酸電泳相關(guān)儀器
        2.2.9 蛋白質(zhì)檢測相關(guān)儀器
        2.2.10 顯微鏡
        2.2.11 熒光素酶活性檢測儀器
        2.2.12 其他儀器
    2.3 實(shí)驗(yàn)方法
        2.3.1 RPASMC原代細(xì)胞分離
            2.3.1.1 大鼠心臟和肺動脈組織獲取
            2.3.1.2 細(xì)胞分離
        2.3.2 瞬時(shí)轉(zhuǎn)染
            2.3.2.1 質(zhì)粒PEI轉(zhuǎn)染
            2.3.2.2 miRNAmimic和siRNA的SI轉(zhuǎn)染
        2.3.3 細(xì)胞培養(yǎng)
            2.3.3.1 常氧下細(xì)胞培養(yǎng)
            2.3.3.2 缺氧下細(xì)胞培養(yǎng)
        2.3.4 熒光定量PCR
            2.3.4.1 總RNA的提取
            2.3.4.2 miRNA的檢測
            2.3.4.3 mRNA的檢測
        2.3.5 Westernblot檢測蛋白質(zhì)的表達(dá)水平
        2.3.6 細(xì)胞功能實(shí)驗(yàn)
            2.3.6.1 細(xì)胞增殖實(shí)驗(yàn)
            2.3.6.2 細(xì)胞遷移實(shí)驗(yàn)
        2.3.7 miRNA靶基因的生物學(xué)預(yù)測
        2.3.8 3′-UTR熒光素酶報(bào)告基因測定
        2.3.9 數(shù)據(jù)處理
第3章 結(jié)果與分析
    3.1 miR-1281通過靶向HDAC4調(diào)控RPASMC的增殖和遷移
        3.1.1 在PASMCs中PDGFBB誘導(dǎo)miR-1281顯著下調(diào)
        3.1.2 miR-1281抑制PASMCs的增殖和遷移
        3.1.3 在RPASMC細(xì)胞中HDAC4是miR-1281的靶基因
        3.1.4 HDAC4促進(jìn)PASMCs的增殖和遷移
        3.1.5 PDGFBB誘導(dǎo)DNMT1上調(diào)進(jìn)而抑制miR-1281的表達(dá)
        3.1.6 在低氧刺激的PASMCs、MCT誘導(dǎo)PAH大鼠的肺動脈和CHD-PAH患者的血清中miR-1281表達(dá)水平下調(diào)
        3.1.7 miR-1281調(diào)節(jié)肺動脈平滑肌細(xì)胞的分子機(jī)制模型
    3.2 PDGFBB通過上調(diào)DNMT1抑制EP300進(jìn)而調(diào)控RPASMC的增殖和遷移
        3.2.1 在PASMCs中PDGFBB誘導(dǎo)EP300顯著下調(diào)
        3.2.2 不同細(xì)胞中,PDGFBB刺激下EP300的表達(dá)情況
        3.2.3 EP300抑制PASMCs的增殖和遷移
        3.2.4 在PDGF通路中調(diào)控EP300的EGR1不是關(guān)鍵機(jī)制
        3.2.5 過表達(dá)miR-1281并不能調(diào)控EP300的表達(dá)
        3.2.6 敲除CpG島能上調(diào)EP300的表達(dá)
        3.2.7 在PDGFBB刺激下,5-aza-dc能回復(fù)EP300的表達(dá)
        3.2.8 PDGFBB刺激下PASMC中DNMT家族的表達(dá)情況
        3.2.9 EP300調(diào)節(jié)肺動脈平滑肌細(xì)胞的分子機(jī)制模型
第4章 討論
    4.1 在肺動脈平滑肌細(xì)胞的異常增殖中,miR-1281參與調(diào)控的信號通路及靶基因
    4.2 在PDGF信號通路中,DNMT1在肺動脈高壓中的調(diào)控機(jī)制
    4.3 在PDGF信號通路中,參與調(diào)控組蛋白乙�；D(zhuǎn)移酶EP300的分子機(jī)制
第5章 結(jié)論
參考文獻(xiàn)
附錄
致謝
攻讀碩士學(xué)位期間的研究成果



本文編號：3768999