目的:利用肺炎衣原體（Chlamdia pneumoniae,C.pneumoniae）體外感染血管內(nèi)皮細胞（vascular endothelial cell,VEC）模型,觀察 C.pneumoniae 感染對 VEC 遷移和血管新生的影響;探討IQGAP1-N-WASP信號通路在C.pneumoniae感染誘導VEC遷移和血管新生中的作用。方法:1.C.pneumoniae增殖培養(yǎng)后體外感染VEC;2.采用Western blot技術檢測C.pneumoniae感染的VEC內(nèi)IQGAP1蛋白的表達水平;3.免疫共沉淀法檢測C.pneumoniae感染后IQGAP1的磷酸化水平;4.CCK-8 檢測 Src抑制劑 PP2 以及 PKC 抑制劑 GF 109203X 和 chelerythrine 在使用濃度及作用時間內(nèi)對VEC活力的影響;5.免疫熒光法確定PP2、GF109203X以及chelerythrine在使用濃度及作用時間內(nèi)對C.pneumoniae感染率的影響;6.分別用PP2、GF 109203X和chelerythrine預處理后,免疫共沉淀法檢測C.pneumoni... 

【文章頁數(shù)】：124 頁

【學位級別】：博士

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中文摘要
Abstract
縮略語
前言
    研究現(xiàn)狀、成果
    研究目的、方法
一、C.pneumoniae感染對IQGAP1活性的影響
    實驗一 C.pneumoniae感染對IQGAP1活性的影響
        1.1 實驗材料
            1.1.1 細胞
            1.1.2 菌株
            1.1.3 主要試劑
            1.1.4 主要儀器
            1.1.5 主要試劑的配制
        1.2 實驗方法
            1.2.1 VEC的培養(yǎng)、復蘇、傳代與凍存
            1.2.2 C.pneumoniae的增殖培養(yǎng)
            1.2.3 C.pneumoniae感染VEC
            1.2.4 Western blot分析C.pneumoniae感染后VEC IQGAP1內(nèi)表達水平
            1.2.5 免疫共沉淀分析C.pneumoniae感染后VEC IQGAP1的磷酸化水平
            1.2.6. 統(tǒng)計學處理
        1.3 結(jié)果
            1.3.1. C.pneumoniae感染對VEC IQGAP1蛋白表達水平的影響
            1.3.2. C.pneumoniae感染可誘導VEC IQGAP1酪氨酸磷酸化
            1.3.3. C.pneumoniae感染促進VEC IQGAP1絲氨酸磷酸化
    實驗二 Src、PKC在C.pneumoniae感染激活IQGAP1中的作用
        2.1 實驗材料
            2.1.1. 細胞
            2.1.2 菌株
            2.1.3 主要試劑
            2.1.4 主要儀器
            2.1.5 主要試劑的配制
        2.2 實驗方法
            2.2.1. C.pneumoniae感染VEC
            2.2.2. CCK-8檢測PP2、GF 109203X和chelerythrine對VEC活力的影響
            2.2.3. 免疫共沉淀法檢測PP2對C.pneumoniae感染誘導的VEC IQGAP1酪氨酸磷酸化的影響
            2.2.4. 免疫共沉淀法檢測GF 109203X和chelerythrine對C.pneumoniae感染誘導VEC IQGAP1絲氨酸磷酸化的影響
            2.2.5. 統(tǒng)計學處理
        2.3 結(jié)果
            2.3.1. PP2、GF 109203X和chelerythrine對VEC活力的影響
            2.3.2. PP2可抑制C.pneumoniae感染誘導的IQGAP1酪氨酸磷酸化
            2.3.3. GF 109203X和chelerythrine均可抑制C.pneumoniae感染誘導的VEC IQGAP1絲氨酸磷酸化
二、IQGAP1在C.pneunioniae感染誘導的VEC遷移和血管新生中的作用
    1. 實驗材料
        1.1. 細胞
        1 2. 菌株
        1.3. 主要試劑
        1.4. 主要儀器
        1.5. 主要試劑的配制
    2. 實驗方法
        2.1. C.pneumoniae感染VEC
        2.2. RNA干擾
        2.3 免疫熒光法觀察PP2、GF 109203X以及chelerythrine對C.pneumoniae感染率的影響
        2.4. 實驗分組
        2.5. Wound healing實驗
        2.6. Transwell實驗
        2.7. 微管腔形成實驗
        2.8. 肌動蛋白聚合實驗
        2.9. 免疫熒光雙標染色
        2.10. 統(tǒng)計學處理
    3. 結(jié)果
        3.1. RNA干擾效能達到實驗標準
        3.2. 免疫熒光法確定PP2、GF 109203X以及chelerythrine對C.pneumoniae感染率的影響
        3.3. Wound healing實驗觀察IQGAP1在C.pneumoniae感染誘導的VEC遷移中的作用
        3.4. Transwell實驗觀察IQGAP1在C.pneumoniae感染誘導的VEC遷移中的作用
        3.5. 微管腔形成實驗觀察IQGAP1在C.pneumoniae感染誘導的VEC血管新生中的作用
        3.6. 激光掃描共聚焦顯微鏡觀察C.pneumoniae感染對VEC肌動蛋白聚合的影響
        3.7. 免疫熒光雙標染色法觀察C.pneumoniae感染VEC后IQGAP1和肌絲的共定位
三、IQGAP1通過N-WASP調(diào)控C.pneumoniae感染誘導的VEC遷移和血管新生
    1. 實驗材料
        1.1. 細胞
        1.2. 菌株
        1.3. 主要試劑
        1.4. 主要儀器
        1.5. 主要試劑的配制
    2. 實驗方法
        2.1. C.pneumoniae感染VEC
        2.2. 實驗分組
        2.3. 免疫共沉淀觀察IQGAP1與N-WASP之間的相互作用
        2.4. 共聚焦顯微鏡觀察IQGAP1對C.pneumoniae感染誘導VEC肌動蛋白和N-WASP共定位的影響
        2.5. Western blot檢測IQGAP1對C.pneumoniae感染誘導的N-WASP磷酸化水平的影響
        2.6. 統(tǒng)計學處理
    3. 結(jié)果
        3.1. IQGAP1與N-WASP之間的相互作用
        3.2. IQGAP1對C.pneumoniae感染誘導VEC肌絲和N-WASP共定位的影響
        3.3. IQGAP1對C.pneumoniae感染誘導的VEC N-WASP磷酸化的影響
討論
小結(jié)
結(jié)論
論文創(chuàng)新點
參考文獻
發(fā)表論文和參加科研情況說明
附錄
綜述 IQGAP1在動脈粥樣硬化發(fā)生發(fā)展中的作用研究進展
    綜述參考文獻
致謝


【參考文獻】：
期刊論文
[1]肺炎衣原體感染通過PI3K通路誘導血管內(nèi)皮細胞遷移[J]. 權偉,張利軍,陳寧,沈炳玲,葉靜,王蓓蓓,劉欣,張麗莙.  中國病理生理雜志. 2010(07)
[2]Atherosclerosis,inflammation and Chlamydia pneumoniae[J]. Giovanni Fazio,Maria Giovino,Alessandro Gullotti,Daniela Bacarella,Giuseppina Novo,Salvatore Novo.  World Journal of Cardiology. 2009(01)
[3]黃連素通過PI3K抑制肺炎衣原體感染誘導的血管內(nèi)皮細胞遷移[J]. 權偉,張利軍,陳寧,王蓓蓓,張麗莙.  中國動脈硬化雜志. 2009(11)

碩士論文
[1]肺炎衣原體感染通過激活Racl誘導血管平滑肌細胞遷移[D]. 張俊霞.天津醫(yī)科大學 2013



本文編號：3703543