目的：研究一種新型的AAV重組病毒（rAAV8-hFVIII）治療血友病A的治療效果,并在病毒設計構建中引入定點整合概念,為血友病A的基因治療提供方向。方法：動物實驗方面,我們在本實驗中引入兩個種群的老鼠：攜帶人體AAVS1位點的轉基因小鼠（AAV小鼠）和敲除FⅧ的基因小鼠（FVIII KO小鼠）,將其分為高壓注射組,正常注射組和溶劑空白對照組。目的基因表達方面,我們使用ELISA檢測hFVIII蛋白1、7、14、21、35、60、90天抗原抗體表達情況；在100天時,殺死小鼠取其心、肝、脾、肺、腎,使用RT-PCR檢測病毒轉錄情況。生理出凝血指標方面,我們采用活化部分凝血活酶時間檢測法來觀察30天時FVIII KO小鼠內源性凝血指標的變化,同時用小鼠斷尾法檢測小鼠生理出血時間的變化。AAVS1特異位點整合方面,我們在部分AAV小鼠上加入Rep共同高壓注射,使用nested PCR檢測接頭序列,并在100天時對小鼠進行肝臟部分切除手術,使用Real-time PCR觀察其表達變化。結果：FⅧ抗原檢測結果顯示,在使用相同給藥方式的條件下,兩種不同模型動物的蛋白表達相似,一般在病毒注射60... 

【文章來源】：揚州大學江蘇省

【文章頁數】：64 頁

【學位級別】：碩士

【文章目錄】：
中文摘要
Abstract
目錄
英文縮略詞
第一章 前言
第二章 材料與方法
    一、實驗材料
        1、動物實驗材料
        2、其它制劑、溶液
        3、常用試劑配制
        4、主要儀器設施
        5、計算機軟件及數據庫
    二、實驗方法
        1、瓊脂糖凝膠電泳方法
        2、pMD18-T載體和目的基因的連接
        3、質粒的轉化
        4、質粒的小量制備
        5、組織DNA抽提
        6、組織mRNA抽提
        7、高壓尾靜脈快沖注射
        8、動物實驗與血漿、血清采集
        9、酶聯免疫吸附實驗(ELISA)檢測小鼠血漿中hFⅧ抗原
        10、FⅧKO小鼠出血時間測定與APTT部分凝血酶激活時間檢測
        11、RT-PCR檢測hFⅧ mRNA
        12、肝臟部分切除
        13、Real-time PCR檢測病毒在體內的表達
        14、鼠肝PCR擴增檢測病毒-AAVS1整合位點接頭序列
        15、ELISA檢測小鼠血清中hFⅧ抗體的相對水平
        16、統(tǒng)計學分析
第三章 實驗結果
    一、hFⅧ表達及其抗體形成
        1、hFⅧ在實驗小鼠體內的表達情況
        2、抗hFⅧ抗體水平
    二、模型動物的出、凝血指標
        1、小鼠出血時間
        2、APTT部分活化的凝血活酶時間
    三、病毒的體內分布、表達及特異性位點整合情況
        1、RT-PCR檢測病毒進入肝臟后在器官內分布情況
        2、nested PCR檢測AAVS1接頭位點序列
        3、Real-time PCR檢測肝切前后肝臟rAAV8-hFⅧ表達
第四章 討論與結論
參考文獻
綜述
    參考文獻
攻讀學位期間發(fā)表的學術論文目錄
致謝



本文編號：3639712