發(fā)布時間：2021-12-22 05:04

　　目的肺動脈高壓（PAH）的特征性病理變化是肺動脈平滑肌細胞（PASMCs）異常增殖,導致肺小動脈管腔進行性狹窄,兒童也是發(fā)生PAH的主要人群之一。Erk1/2的磷酸化與多種細胞的增殖相關。曲前列環(huán)素（Trep）近期已用于治療PAH,其機制需進一步研究探討。本研究以PASMCs為研究對象,探討Trep對PAMSCs增殖的影響及Erk1/2磷酸化水平的變化,旨在探究治療PAH的新思路。方法復蘇PASMCs,顯微鏡下觀察細胞形態(tài),免疫熒光方法鑒定細胞。使用不同濃度的血小板衍生生長因子（PDGF）促進PAMSCs增殖,找到合適濃度的PDGF建立增殖模型。先觀察Trep對PAMSCs增殖的影響并檢測Erk1/2磷酸化水平,實驗分為:對照組,Trep組,PDGF組,PDGF+Trep組。顯微鏡下觀察各組細胞形態(tài),MTT法檢測各組細胞活性,Western Blot法檢測各組細胞內(nèi)增殖細胞核抗原（PCNA）、t-Erk1/2及p-Erk1/2蛋白表達;再使用Erk1/2磷酸化抑制劑PD98059代替Trep,重復上述實驗,觀察PD98059對PAMSCs增殖的影響及Erk1/2磷酸化水平。結果（1）P... 

【文章來源】：江蘇大學江蘇省

【文章頁數(shù)】：70 頁

【學位級別】：碩士

【部分圖文】：

肺動脈平滑肌細胞形態(tài)觀察以及α-SMA免疫熒光鑒定

圖 3.1 96 孔板示意圖Figure 3.1 schematic diagram of cell culture plate注意事項：在孔內(nèi)加入蛋白標準品工作液以及 AB 工作液時，勿產(chǎn)生氣（9）分離膠與濃縮膠配制：取 1.5mm 規(guī)格玻璃板，使用雙蒸水洗凈后干燥，放入夾板中，向空隙內(nèi)加入雙蒸水檢漏 5 分鐘，若水平面下降不明表示不漏。檢漏后倒扣，再次待干燥。因本次實驗檢測蛋白分子量在 30-5，故選用 12%SDS-PAGE 分離膠（下層膠，最佳分離范圍 12-60kD）。取 5杯，用雙蒸水洗凈后待自然干燥，加入 3mL 雙蒸水，6mL30%Acr-Bis，5 Tris（pH8.8），0.15mL 10% SDS，0.15mL 10%過硫酸銨，輕輕攪拌混勻取 0.006mLTEMED 加入上述混合液中，再次攪拌，加入玻璃板縫隙中，入異丙醇覆蓋。待下層膠凝固后（室溫下約 1 小時），配制濃縮膠（上層 50mL 燒杯，用雙蒸水洗凈后待自然干燥，加入 4.1mL 雙蒸水，1mL30%

出梳子時需垂直向上，勿左右晃動；孔內(nèi)加電轉：裁剪合適大小的 PVDF 膜，并做好標醇中備用，將 2 片轉膜濾紙浸泡于 1×電轉出玻璃板，浸泡于 1×電轉液中，使用小塑料片轉膜濾紙上，使用光滑玻璃棒擠去凝膠與 PVDF 膜，將 PVDF 膜放置于轉膜濾紙上，膠之間的氣泡擠去。將另一片轉膜濾紙覆蓋氣泡。按圖 3.3 所示將夾板夾緊（從上至下—PVDF 膜——凝膠——轉膜濾紙——黑入適當?shù)?4℃1×電轉液，并放入冰盒，并在，注意正負極。將參數(shù)設置為電流 300mA內(nèi)開始電轉。

【參考文獻】：
期刊論文
[1]治療肺動脈高壓藥物賽樂西帕[J]. 郭宗儒,Asaki T,Kuwano K,Morrison K.  藥學學報. 2018(12)
[2]曲前列環(huán)素對大鼠肺動脈高壓模型的治療作用及其機制[J]. 張霞,王楊紀,王騫,王艷,呂季陽,呂進泉.  江蘇大學學報(醫(yī)學版). 2016(06)
[3]改良前處理的原代組織塊貼壁法培養(yǎng)大鼠肺動脈平滑肌細胞[J]. 華亮,朱玲,錢志強,岳云,李葉麗,楊丹莉.  遵義醫(yī)學院學報. 2016(02)
[4]前列環(huán)素及其類似物在肺動脈高壓中的應用[J]. 顏平,寧寧,荊志成.  世界臨床藥物. 2014(06)
[5]機械牽張力和去甲腎上腺素協(xié)同激活小鼠血管平滑肌細胞α1-腎上腺素能受體-ERK1/2信號促進細胞增殖[J]. 劉樹迎,李宇煌,張征宇,張敏,汪照靜,李晨,寧粉,黃錦桃,李朝紅.  中國動脈硬化雜志. 2011(03)
[6]ERK對慢性哮喘大鼠氣道平滑肌細胞凋亡的影響[J]. 白晶,劉先勝,徐永健,張珍祥,謝敏,倪望.  細胞與分子免疫學雜志. 2010(08)
[7]細胞外信號調(diào)節(jié)激酶1／2信號通路在慢性哮喘模型大鼠支氣管平滑肌細胞遷移功能變化中的調(diào)控作用[J]. 謝敏,劉先勝,徐永健,張珍祥,白晶,倪望,陳士新.  生理學報. 2007(01)

博士論文
[1]TMEM16A對高肺血流性肺動脈高壓調(diào)控機制的研究[D]. 王凱.廣西醫(yī)科大學 2015

碩士論文
[1]FPR和TLR9在缺氧時血管平滑肌細胞炎癥因子IL-6和IL-8產(chǎn)生中的作用[D]. 史詩.重慶醫(yī)科大學 2018
[2]血流動力學變化對血管重構調(diào)控機制初步實驗研究[D]. 郭占芳.中國人民解放軍醫(yī)學院 2015



本文編號：3545813