目的:檢測SPAG6基因在MDS或MDS-AML患者骨髓標本的表達情況,以及構建pGC-SPAG6-shRNA重組慢病毒載體靶向干預SPAG6基因表達,探索SPAG6基因表達水平下調后對骨髓增生異常綜合征細胞株SKM-1細胞增殖的影響及其可能的機制。方法:收集MDS或MDS-AML患者骨髓標本21例（MDS 11例,MDS-AML 10例）,非癌癥患者對照骨髓標本7例。將新鮮的骨髓標本提取單個核細胞,利用實時熒光定量逆轉錄聚合酶鏈反應（qRT-PCR）檢測SPAG6 mRNA的相對表達量。對已上傳至TCGA數據庫的急性髓系白血�。ˋML）患者的骨髓標本SPAG6 mRNA表達分析及Kaplan-Meier生存曲線分析。實驗分為3組:Blank組、NC-LV組及SPAG6-LV組。將設計好的陰性對照空載重組慢病毒載體NC-shRNA及靶基因重組慢病毒載體SPAG6-shRNA轉染至對數期SKM-1細胞中,利用倒置熒光顯微鏡觀察各組細胞的轉染情況,流式細胞檢測術檢測細胞轉染率,qRT-PCR及Western blotting法驗證SPAG6基因干擾效果。利用CCK-8法檢測SPAG6基因表... 

【文章來源】：重慶醫(yī)科大學重慶市

【文章頁數】：53 頁

【學位級別】：碩士

【部分圖文】：

SPAG6基因在MDS或MDS-AML患者骨髓細胞中表達Figure1ExpressionofSPAG6geneinbonemarrowcellsofpatientswithMDSorMDS-AML(A)DifferentialexpressionofSPAG6mRNAincancer-freepatientsandMDSorMDS-AML

圖 2 TCGA 數據庫已發(fā)表的 AML 患者骨髓標本 SPAG6 mRNA 表達的分析。Figure2Analysis of SPAG6 mRNA expression in bone marrow samples ofAML patienpublished in TCGA(A) Differential expression of SPAG6 mRNA in published profiles from bone marrowecimens of patients with AML. (B) Kaplan-Meier overall survival curves for all 135 patwithAML stratified by high and low expression of SPAG6. ***p＜0.001. 檢測慢病毒載體轉染 SKM-1 細胞效果用本課題組前期已經篩選好最佳靶序列的 SPAG6-shRNA 慢病毒轉染對SKM-1 細胞，以 MOI 值 40 轉染，經過 0.5μg/ml 嘌呤霉素完全培養(yǎng)基培養(yǎng)通完全培養(yǎng)基。感染后 6 天倒置熒光顯微鏡下觀察轉染后細胞 GFP 熒光：細胞抱團生長，大量綠色熒光蛋白表達使細胞呈綠色；取一部分轉染流式細胞術檢測細胞轉染率，結果顯示轉染率均在 80%以上(圖 3)。

圖 3 慢病毒載體轉染 SKM-1 細胞Figure3 SKM-1 cells were transfected with lentivirus vectornsense negative control group; SPAG6-LV，short hairpin RNA(shRvector group. SPAG6 基因的干預效果載體轉染 SKM-1 細胞后，取轉染培養(yǎng)后 7 天的 Blank、 組細胞，分別提取各組細胞的總 RNA 與總蛋白，用 qRT-PCR析 SPAG6 基因的干預效果，結果表明 SPAG6-LV 組細胞 SP 4)。


本文編號：3504355