目的:檢測SPAG6基因在MDS或MDS-AML患者骨髓標(biāo)本的表達(dá)情況,以及構(gòu)建pGC-SPAG6-shRNA重組慢病毒載體靶向干預(yù)SPAG6基因表達(dá),探索SPAG6基因表達(dá)水平下調(diào)后對(duì)骨髓增生異常綜合征細(xì)胞株SKM-1細(xì)胞增殖的影響及其可能的機(jī)制。方法:收集MDS或MDS-AML患者骨髓標(biāo)本21例（MDS 11例,MDS-AML 10例）,非癌癥患者對(duì)照骨髓標(biāo)本7例。將新鮮的骨髓標(biāo)本提取單個(gè)核細(xì)胞,利用實(shí)時(shí)熒光定量逆轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈反應(yīng)（qRT-PCR）檢測SPAG6 mRNA的相對(duì)表達(dá)量。對(duì)已上傳至TCGA數(shù)據(jù)庫的急性髓系白血�。ˋML）患者的骨髓標(biāo)本SPAG6 mRNA表達(dá)分析及Kaplan-Meier生存曲線分析。實(shí)驗(yàn)分為3組:Blank組、NC-LV組及SPAG6-LV組。將設(shè)計(jì)好的陰性對(duì)照空載重組慢病毒載體NC-shRNA及靶基因重組慢病毒載體SPAG6-shRNA轉(zhuǎn)染至對(duì)數(shù)期SKM-1細(xì)胞中,利用倒置熒光顯微鏡觀察各組細(xì)胞的轉(zhuǎn)染情況,流式細(xì)胞檢測術(shù)檢測細(xì)胞轉(zhuǎn)染率,qRT-PCR及Western blotting法驗(yàn)證SPAG6基因干擾效果。利用CCK-8法檢測SPAG6基因表... 

【文章來源】：重慶醫(yī)科大學(xué)重慶市

【文章頁數(shù)】：53 頁

【學(xué)位級(jí)別】：碩士

【部分圖文】：

SPAG6基因在MDS或MDS-AML患者骨髓細(xì)胞中表達(dá)Figure1ExpressionofSPAG6geneinbonemarrowcellsofpatientswithMDSorMDS-AML(A)DifferentialexpressionofSPAG6mRNAincancer-freepatientsandMDSorMDS-AML

圖 2 TCGA 數(shù)據(jù)庫已發(fā)表的 AML 患者骨髓標(biāo)本 SPAG6 mRNA 表達(dá)的分析。Figure2Analysis of SPAG6 mRNA expression in bone marrow samples ofAML patienpublished in TCGA(A) Differential expression of SPAG6 mRNA in published profiles from bone marrowecimens of patients with AML. (B) Kaplan-Meier overall survival curves for all 135 patwithAML stratified by high and low expression of SPAG6. ***p＜0.001. 檢測慢病毒載體轉(zhuǎn)染 SKM-1 細(xì)胞效果用本課題組前期已經(jīng)篩選好最佳靶序列的 SPAG6-shRNA 慢病毒轉(zhuǎn)染對(duì)SKM-1 細(xì)胞，以 MOI 值 40 轉(zhuǎn)染，經(jīng)過 0.5μg/ml 嘌呤霉素完全培養(yǎng)基培養(yǎng)通完全培養(yǎng)基。感染后 6 天倒置熒光顯微鏡下觀察轉(zhuǎn)染后細(xì)胞 GFP 熒光：細(xì)胞抱團(tuán)生長，大量綠色熒光蛋白表達(dá)使細(xì)胞呈綠色；取一部分轉(zhuǎn)染流式細(xì)胞術(shù)檢測細(xì)胞轉(zhuǎn)染率，結(jié)果顯示轉(zhuǎn)染率均在 80%以上(圖 3)。

圖 3 慢病毒載體轉(zhuǎn)染 SKM-1 細(xì)胞Figure3 SKM-1 cells were transfected with lentivirus vectornsense negative control group; SPAG6-LV，short hairpin RNA(shRvector group. SPAG6 基因的干預(yù)效果載體轉(zhuǎn)染 SKM-1 細(xì)胞后，取轉(zhuǎn)染培養(yǎng)后 7 天的 Blank、 組細(xì)胞，分別提取各組細(xì)胞的總 RNA 與總蛋白，用 qRT-PCR析 SPAG6 基因的干預(yù)效果，結(jié)果表明 SPAG6-LV 組細(xì)胞 SP 4)。


本文編號(hào)：3504355