血友病B（hemophilia B）是人凝血IX因子（human clotting factor Ⅸ, hFⅨ）缺乏所引起的一種出血性疾病。基因治療是遺傳型疾病根本的治療方法。然而遺傳病基因治療的應(yīng)用依然面臨兩難的局面。免疫原性風(fēng)險[1-4]和遺傳安全性[1-4]為其應(yīng)用中首先需要解決的問題。在前期成功使用rep-RBE定點整合轉(zhuǎn)基因方法通過小鼠尾靜脈注射方法獲得hFIX長時間表達的實驗基礎(chǔ)上,本研究構(gòu)建一種含CMV啟動子-RBE元件-TK1基因的篩選標記的人凝血因子IX表達框架的質(zhì)粒pCMV-RBE-TK1-N2-EFlα-hFIXml。該質(zhì)粒和rep表達質(zhì)粒共轉(zhuǎn)染哺乳動物細胞可用于構(gòu)建定點整合于AAVS1位點表達人類凝血因子Ⅸ的穩(wěn)定細胞。特點為：攜帶有RBE順式元件可以介導(dǎo)rep蛋白依賴的AAVS1位點整合；Neo正篩選基因可以用G418篩選獲得整合細胞；RBE元件位于TK1基因和啟動子之間,可以用阿昔洛韋去除沒有RBE參與的非定點整合細胞；最后獲得定點整合于AAVS1位點穩(wěn)定表達人凝血因子IX的細胞。使用該質(zhì)粒制備穩(wěn)定表達人類凝血因子IX的穩(wěn)定細胞,一方面正負雙重篩選可以防止細胞... 

【文章來源】：復(fù)旦大學(xué)上海市 211工程院校 985工程院校 教育部直屬院校

【文章頁數(shù)】：97 頁

【學(xué)位級別】：碩士

【部分圖文】：

EL工SA鑒定hFIX基因定點整合系統(tǒng)修飾細胞系hFIX表達情況

Ｈ、?ＺＮＦ４０３基因３’ＵＴＲ焚光素酶報告基因載體構(gòu)建??人ＺＮＦ４０３基因３’ＵＴＲ全長４５９ｂｐ，僅克隆４３３ｂｐ?（不包含ｐｏｌｙＡ序列），見??圖２。將測序結(jié)果與ＧｅｎＢａｎｋ中標準序列進行Ｂｌａｓｔ比對，結(jié)果顯示與標準序??列一致。??圖２人ＺＮＦ４０３基因３ＭＪＴＲ序列瓊脂糖凝膠電泳結(jié)果??１：人?ＺＮＦ４０３?基因?３’ＵＴＲ?序列；Ｍ：?ＴａｋａｒａＤＬ２０００Ｍａｒｋｅｒ??四、巧光素酶活性實驗初步鑒定鉛向作用ＺＮＦ４０３基因的ｍｉＲＮＡ??將陰性對照質(zhì)粒ｍｉＲＮＡｍｉｍｉｃ?（ＮＣ）和預(yù)測得到的４個ｍｉＲＮＡｓｍｉｍｉｃ與??重組巧光素酶報告質(zhì)粒ｐｈＥＷ－ｌｕｃ－ＺＮＦ４０３?３’ＵＴＲ共同轉(zhuǎn)染ＨＥＫ２Ｗ細胞４化后，??檢測巧光素酶活性，Ｗ此來判斷各ｍｉＲＮＡ對ＺＮＦ４０３的抑制功能。結(jié)果顯示，??與對照ｍｉＲＮＡ－ＮＣ組相比，實驗姐中ＺＮＦ４０３巧光素酶活性沒有顯著降低，變??化甚微，不存在統(tǒng)計學(xué)意義（圖３）。說明４種ｍｉＲＮＡ——ｍｉ艮－２３，ｍｉ民－１９９，??ｍｉＲ－１３５?和?ｌｅｔ－７ｇ＊，不調(diào)控?ＺＮＦ４０３?表達。??然而，與?ｐｈＥＷ－ｌｕｃ－ＺＮＦ４０３?３’ＵＴ民野生型組比較，ｐｈＥＷ－ｌｕｃ－ＺＮＦ４０３??３，ＵＴＲ對應(yīng)ｍｉＲＮＡ預(yù)祀點點突變組（與ｐｈＥＷ－ｌｕｃ－ＺＮＦ４０３?３’ＵＴＲ?ＷＴ質(zhì)粒共??轉(zhuǎn)）ＺＮＦ４０３巧光素酶活性升高２．５－３倍

檢測巧光素酶活性，Ｗ此來判斷各ｍｉＲＮＡ對ＺＮＦ４０３的抑制功能。結(jié)果顯示，??與對照ｍｉＲＮＡ－ＮＣ組相比，實驗姐中ＺＮＦ４０３巧光素酶活性沒有顯著降低，變??化甚微，不存在統(tǒng)計學(xué)意義（圖３）。說明４種ｍｉＲＮＡ——ｍｉ艮－２３，ｍｉ民－１９９，??ｍｉＲ－１３５?和?ｌｅｔ－７ｇ＊，不調(diào)控?ＺＮＦ４０３?表達。??然而，與?ｐｈＥＷ－ｌｕｃ－ＺＮＦ４０３?３’ＵＴ民野生型組比較，ｐｈＥＷ－ｌｕｃ－ＺＮＦ４０３??３，ＵＴＲ對應(yīng)ｍｉＲＮＡ預(yù)祀點點突變組（與ｐｈＥＷ－ｌｕｃ－ＺＮＦ４０３?３’ＵＴＲ?ＷＴ質(zhì)粒共??轉(zhuǎn)）ＺＮＦ４０３巧光素酶活性升高２．５－３倍，存在顯著差異（ｐ＜０．０１），具有統(tǒng)計學(xué)??意義。由于野生型實驗組與對照組間無顯著差異，故野生型組數(shù)據(jù)無意義（圖３）。??５９??

【參考文獻】：
期刊論文
[1]血友病A的基因治療[J]. 劉慕君,劉艷平,劉雄昊.  中國臨床藥理學(xué)與治療學(xué). 2010(08)
[2]中國血友病B生物基因治療研究狀況[J]. 陳金中,薛京倫.  科學(xué)通報. 2009(18)
[3]LCRG1基因啟動子關(guān)鍵順式調(diào)節(jié)元件的鑒定[J]. 謝海龍,陳主初,李金花,曾龍武,譚桂煌.  生物化學(xué)與生物物理進展. 2009(05)
[4]Sp1和Egr-1對LCRG1基因啟動子轉(zhuǎn)錄活性的調(diào)節(jié)研究[J]. 謝海龍,曾龍武,周曉軍.  醫(yī)學(xué)研究生學(xué)報. 2009(04)
[5]血友病診斷和治療的專家共識[J].   診斷學(xué)理論與實踐. 2008(05)
[6]microRNA與腫瘤[J]. 周凡,莊詩美.  生命科學(xué). 2008(02)
[7]血友病的診斷和治療[J]. 袁凱鋒,廖小梅.  現(xiàn)代臨床醫(yī)學(xué). 2007(03)
[8]microRNA及其應(yīng)用前景[J]. 鄭玉姝,趙樸,趙宏坤.  生物技術(shù)通訊. 2007(01)
[9]轉(zhuǎn)染LCRG1基因的喉癌細胞差異蛋白質(zhì)分析[J]. 章曉鵬,肖志強,陳主初,李萃,李建玲,余艷輝,歐陽詠梅,馮雪萍,張鵬飛.  癌癥. 2006(01)
[10]血友病基因治療的研究進展[J]. 高立艷,徐開林,潘秀英.  國外醫(yī)學(xué).輸血及血液學(xué)分冊. 2005(05)

博士論文
[1]MicroRNA-23a在膠質(zhì)瘤中的功能和作用機制研究[D]. 連世忠.山西醫(yī)科大學(xué) 2013
[2]MicroRNA-23a通過線粒體凋亡途徑調(diào)節(jié)結(jié)腸癌化療敏感性的機制研究[D]. 商京麗.第二軍醫(yī)大學(xué) 2011
[3]microRNA在TNF-α誘導(dǎo)的人臍靜脈內(nèi)皮細胞凋亡中作用及機制的研究[D]. 阮溦.中南大學(xué) 2010

碩士論文
[1]靶向作用喉癌候選抑瘤基因LCRG1的microRNAs的初步篩選研究[D]. 趙娟霞.南華大學(xué) 2013
[2]MicroRNA-23b、MicroRNA-200b在系統(tǒng)性紅斑狼瘡患者血漿中表達及臨床意義研究[D]. 龔德玉.中南大學(xué) 2012



本文編號：3482724