目的:探討敲低C3G（Crk SH3域結(jié)合鳥嘌呤核苷酸交換因子）對大鼠梗死后心臟重構(gòu)影響及其機(jī)制研究。方法:構(gòu)建陰性對照（NT CRISPR/Cas9）及C3G CRISPR/Cas9質(zhì)粒,并分別將其包裝成重組慢病毒,篩選有效敲除C3G重組慢病毒。在體實驗,結(jié)扎冠狀動脈左前降支,造大鼠心肌梗死模型。動物實驗分為Sham + NT CRISPR/Cas9、Sham + C3G CRISPR/Cas9、MI + NT CRISPR/Cas9 及 MI + C3G CRISPR/Cas9 組。將 NT CRISPR/Cas9 慢病毒及C3G CRISPR/Cas9慢病毒感染H9C2心肌細(xì)胞及成纖維細(xì)胞,并予以低氧處理建立細(xì)胞低氧模型。離體實驗分為NT CRISPR/Cas9、C3G CRISPR/Cas9、NT CRISPR/Cas9 低氧和 C3G CRISPR/Cas9 低氧等組。于心梗后1周及12周行多普勒超聲檢測心臟結(jié)構(gòu)及功能,且于心梗后12周取大鼠心臟并稱重,HE染色觀察心肌組織學(xué)變化,苦味酸天狼星染色檢測心肌膠原纖維,RT-PCR及免疫組化檢測C3G mRNA及蛋白,Wester... 

【文章來源】：重慶醫(yī)科大學(xué)重慶市

【文章頁數(shù)】：56 頁

【學(xué)位級別】：碩士

【部分圖文】：

圖１重組質(zhì)粒的測序??Ｆｉｇ．ｌ?Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ?ｏｆ?ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ?ｐｌａｓｍｉｄ??

胞密度達(dá)７０％時更換新鮮培養(yǎng)基，分別加入空白、ＮＴ?ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９及３種不同Ｃ３Ｇ??ＣＲＩＳＰＲ７Ｃａｓ９重組慢病毒，培養(yǎng)２４小時后予以更換培養(yǎng)基，當(dāng)細(xì)胞融合度達(dá)到??８５％左右時提取蛋白，進(jìn)行Ｗｅｓｔｅｒｎ?ｂｌｏｔ檢測，結(jié)果表明包裝成功（圖２）。??＾?＾?＾??＾?Ｖ??ｋＤａ?＾?＾??＾７￣?—ＧＡＰＤＨ??１４２－?…－?—ＤＤＫ－Ｃａｓ９??圖２包裝慢＾病毒的驗證??Ｆｉｇ．２?Ｖｅｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ?ｏｆ?ｐｌａｓｍｉｄ?ｐａｃｋａｇｉｎｇ?ｉｎｔｏ?ｌｅｎｔｉｖｉｒｕｓ??１．２．４建立大鼠心肌梗死模型、實驗分組及干預(yù)??根據(jù)Ｌｉｔｗｉｎ方法建立大鼠心肌梗死模型。用１０％的水合氯醛進(jìn)行腹腔麻醉??（３ｍｌ／ｋｇ）后，將大鼠固定在手術(shù)上，備皮，用碘伏消毒并鋪巾。在胸骨上緣約ｌｃｍ??處做一縱行小切口，鈍性分離皮下筋膜及肌肉，充分暴露氣管，于環(huán)狀軟骨下方約??２個氣管環(huán)處做一橫行小切口，充分止血后予以氣管插管，連接呼吸機(jī)；待大鼠呼??吸與呼吸機(jī)同步后，于心臟搏動最明顯處做一縱行切口，長約１．５ｃｍ，鈍性分離皮??下筋膜及肌肉，剪斷一根肋骨，撕開心包，充分暴露心臟，尋找左心耳及其下方的??左冠狀動脈，在左心耳下方約ｌｃｍ處結(jié)扎左冠狀動脈前降支（假手術(shù)組只貫穿，不??結(jié)扎），觀察結(jié)扎遠(yuǎn)端心臟顏色變化，若變成暗紫色提示結(jié)扎成功，依據(jù)實驗分組??于大鼠梗死區(qū)（注射３個點(diǎn)

縫合氣管切口及皮膚，消毒。尾靜脈注射重組慢病毒（５００ｕｌ／周）。??１．２．５細(xì)胞實驗干預(yù)??篩選有效敲除Ｃ３Ｇ的重組慢病毒（圖３）。將相同數(shù)量的Ｈ９Ｃ２細(xì)胞接種于將相??同數(shù)量的Ｈ９Ｃ２細(xì)胞接種于孔板（２份）中，分別感染ＮＴ?ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９和Ｃ３Ｇ??ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９慢病毒，培養(yǎng)４５ｈ。從上述２份孔板中隨機(jī)取出一份將培養(yǎng)基換成ＰＢＳ??后，置于３７°Ｃ、１％０２、９４％Ｎ２、５％Ｃ０２的低氧孵箱中培養(yǎng)１８ｈ，另一份繼續(xù)培??養(yǎng)?１８ｈ，此時細(xì)胞分為?ＮＴ?ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９、Ｃ３Ｇ?ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９、ＮＴ?ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９?低??氧和?Ｃ３ＧＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９?低氧組。收集細(xì)胞，ＲＴ－ＰＣＲ、Ｗｅｓｔｅｒｎ?ｂｌｏｔ、ＣＣＫ－８?及流式??細(xì)胞術(shù)檢測。??＾?＾?＾?＾?＾??＾?＾?＾?＾?＾??Ｚ?Ｚ?Ｚ?Ｚ?Ｚ?Ｚ??ｋＤａ?４?Ｃ？＆?＃?Ｃ？。夕?Ｃ？＞＆??３７一?？一鱗？？?ＧＡＰＤＨ??１２１—??圖３?Ｃ３Ｇ?ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９重組慢病毒篩選??Ｆｉｇ．３?Ｓｅｌｅｃｔｉｎｇ?ｏｆ?Ｃ３Ｇ?ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９?ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ?ｌｅｎｔｉｖｉｒｕｓ??１．２．６超聲心動圖檢測??于心梗后１Ｗ及１２Ｗ，將大鼠腹腔麻醉并備皮，彩色多普勒超聲檢測心臟射血??分?jǐn)?shù)（ＥＦ％），左室舒張末直徑（ＬＶＤｄ）及舒張期左室后壁厚度（ＬＶＰＷｄ）。??１．２．７標(biāo)本采集和心室質(zhì)量測定??心梗后１２Ｗ

【參考文獻(xiàn)】：
期刊論文
[1]C3G基因?qū)9C2心肌細(xì)胞凋亡和增殖的影響[J]. 楊東艷,李剛,張蕾,張志升,扶艷波,胡蘇蕾.  解放軍醫(yī)學(xué)雜志. 2015(08)
[2]鳥苷酸交換因子C3G對心肌細(xì)胞生存力的影響及其可能機(jī)制[J]. 張旭,李剛.  第二軍醫(yī)大學(xué)學(xué)報. 2012(11)



本文編號：3470282