目的:探究USP22對人主動脈血管平滑肌細(xì)胞成骨分化及鈣化的作用以及其相關(guān)機(jī)制。研究方法:用β-磷酸甘油建立鈣化模型,并用茜素紅染色及Western Blot實驗驗證模型是否成功。用鈣定量檢測的方法確認(rèn)雌激素及其受體對高磷誘導(dǎo)的人主動脈血管平滑肌細(xì)胞（HASMCs）的成骨分化及鈣化的作用。用Western Blot實驗及免疫熒光實驗明確高磷情況下USP22的表達(dá)情況。構(gòu)建FLAG-USP22質(zhì)粒模型,用茜素紅染色及Western Blot實驗明確USP22對高磷誘導(dǎo)的HASMCs成骨分化及鈣化的作用。用免疫熒光染色及confocal實驗探究USP22和ERα的共定位,用CO-IP實驗探究USP22和ERα的相互作用。用熒光素酶雙報告實驗及Western Blot實驗探究USP22對ERα轉(zhuǎn)錄活性的調(diào)控作用。用CO-IP及熒光素酶雙報告實驗探究USP22對ERα的調(diào)控作用是否是通過HDAC1實現(xiàn)的。結(jié)果:高磷以劑量依賴性的方式誘導(dǎo)HASMCs成骨分化和鈣化,雌激素以濃度依賴的方式抑制高磷對HASMCs的作用,USP22在高磷誘導(dǎo)的鈣化HASMCs中高表達(dá)且能促進(jìn)高磷誘導(dǎo)的HASMCs鈣化... 

【文章來源】：中國醫(yī)科大學(xué)遼寧省

【文章頁數(shù)】：51 頁

【學(xué)位級別】：碩士

【部分圖文】：

USP22加重β-PG誘導(dǎo)的HASMCs的鈣化

USP22與ERα的定位將HASMCs細(xì)胞均勻鋪于12孔板，第二天按照分組更換含β-PG的培養(yǎng)基并給予雌激素（100nM）刺激或無水乙醇對照，刺激2小時-6小時后固定細(xì)胞進(jìn)行免疫熒光染色

中國醫(yī)科大學(xué)碩士學(xué)位論文213.5HDAC1參與USP22對ERα轉(zhuǎn)錄活性的抑制作用為了探究USP22對ERα的負(fù)向調(diào)控機(jī)制，本實驗引入了組蛋白去乙�；窰DAC。HDAC,可以使核心組織蛋白(H2A、H2BH3和H4)氨基端的賴氨酸殘基脫乙酰化,可以抑制Hela細(xì)胞中ERα的轉(zhuǎn)錄調(diào)控（28847748）。首先，用免疫共沉淀實驗檢測USP22與HDAC1的相互作用，研究結(jié)果表明，無論有沒有β-PG的存在無論有沒有雌激素的刺激，HDAC1都可以與USP22共沉淀（圖3.5A-B）。隨后本實驗用熒光素酶雙報告實驗明確USP22對ERα的下調(diào)是否有HDAC的參與。此處使用了HDAC的抑制劑TSA,實驗結(jié)果發(fā)現(xiàn)USP22能夠抑制ERα的轉(zhuǎn)錄活性，這與之前的實驗結(jié)果相符；TSA可以上調(diào)ERα的轉(zhuǎn)錄活性，而且TSA能夠逆轉(zhuǎn)USP22對ERα轉(zhuǎn)錄活性的抑制作用（圖3.5C）。WesternBlot檢測FLAG的表達(dá)來證明雙報告實驗的轉(zhuǎn)染效率（圖3.5D）。這些結(jié)果表明，USP22對ERα轉(zhuǎn)錄活性的抑制作用有HDAC1的參與，抑制HDAC可以逆轉(zhuǎn)USP22對ERα的抑制作用。圖3.5USP22通過HDAC1抑制ERα的轉(zhuǎn)錄活性A：將HASMCs分別給予含β-PG的培養(yǎng)基或普通培養(yǎng)基培養(yǎng)5天，用USP22抗體或IgG抗體


本文編號：3383561