目的心肌缺血再灌注（Ischemia/Reperfusion,I/R）損傷指發(fā)生于心肌梗死后,血流再灌注時(shí)出現(xiàn)心肌損傷加重的現(xiàn)象。心肌I/R損傷是心功能障礙和心肌細(xì)胞死亡的主要原因。非編碼RNA廣泛參與調(diào)控心肌I/R損傷介導(dǎo)的心肌細(xì)胞凋亡過(guò)程,而環(huán)狀RNA（Circular RNAs,circRNAs）作為結(jié)構(gòu)穩(wěn)定、表達(dá)豐度高的一類非編碼RNA,其潛在參與心肌I/R損傷的分子機(jī)制目前尚不完全清楚。探索心肌I/R損傷的潛在新病理機(jī)制,預(yù)防、減少心肌I/R損傷是目前臨床亟待解決的重要問題。實(shí)驗(yàn)方法第一部分:提取大鼠乳鼠原代心肌細(xì)胞,采用心肌肌鈣蛋白T（cTnT）抗體,應(yīng)用細(xì)胞免疫熒光（Immunofluorescence,IF）方法鑒定SD大鼠心肌細(xì)胞。隨后,對(duì)原代心肌細(xì)胞進(jìn)行體外I/R處理,采用實(shí)時(shí)定量PCR（qPCR）方法檢測(cè) circ-RHOJ.1、miR-124-3p 和神經(jīng)調(diào)節(jié)蛋白 1（neuregulin-1,NRG-1）的 RNA表達(dá)水平;同時(shí),使用蛋白質(zhì)免疫印跡法（Western blot,WB）和IF法檢測(cè)NRG-1的蛋白表達(dá)水平與細(xì)胞定位。進(jìn)一步構(gòu)建大鼠體內(nèi)心肌I/R損... 

【文章來(lái)源】：南方醫(yī)科大學(xué)廣東省

【文章頁(yè)數(shù)】：130 頁(yè)

【學(xué)位級(jí)別】：博士

【部分圖文】：

圖１－１．環(huán)狀ＲＮＡｓ的生成機(jī)制??Ｆｉｇｕｒｅ?１－１．?Ｔｈｅ?ｂｉｏｇｅｎｅｓｉｓ?ｏｆ?ｃｉｒｃＲＮＡｓ??Ａ，基因組ＤＮＡ轉(zhuǎn)錄后，ｐｒｅ－ｍＲＮＡ通過(guò)經(jīng)典剪接途徑生成線性ＲＮＡ

ｒａｓｈａ?〇?〇０，ｃｅｒ?ｎ?ｓｃ??、ＨＨＨＢｉ?？?Ｓ’?ｃａｐ?—ｈ＿?ＡＡＡＡＡＡ??＊？?Ｒ?．?Ｅｘｐｏｒｔｉｎ－５?，ｑ??？?日?＊?）??ｍｉＲＮＡｇｅｎｅ?ｐｒｉ－ｍｉＲＮＡ?ｐｒｅ－ｍｉＲＮＡ?ｐｒｅ－ｍｉＲＮＡ??ｏｒ?ｍｉｒｔｒｏｎ??ｎｕｔｌｅｕ，?ＲＩＳＣ??巾＿?５，?ｃａｐ?—ｉｓｏ?ＡＡＡＭＡ??ｃｙｔｏｐｌａｓｍ??／?＼??ｍＲＮＡ?ｉｎｈｉｂｉｔｉｏｎ?ｏｆ??ｄｅｇｒａｄａｔｉｏｎ?ｔｒａｎｓｌａｔｉｏｎ??圖１－３．?ｍｉＲＮＡｓ的生成過(guò)程和作用機(jī)制［５５】??Ｆｉｇｕｒｅ?１－３．?Ｔｈｅ?ｂｉｏｇｅｎｅｓｉｓ?ａｎｄ?ｒｅｇｕｌａｔｉｎｇ?ｍｅｃｈａｎｉｓｍ?ｏｆ?ｍｉＲＮＡｓ??ｍｉＲＮＡｓ基因通過(guò)ＲＮＡ聚合酶ＩＩ在細(xì)胞核中被轉(zhuǎn)錄為ｍｉＲＮＡｓ初始轉(zhuǎn)錄本??（ｐｒｉ－ｍｉＲＮＡｓ）。隨后，ｐｒｉ－ｍｉＲＮＡｓ被具有ＲＮａｓｅｌｌ丨內(nèi)切酶活性的Ｄｒｏｓｈａ蛋白復(fù)合??體裂解成具有發(fā)卡結(jié)構(gòu)的前體ｍｉＲＮＡｓ?（ｐｒｅ－ｍｉＲＮＡｓ）�；蛘撸穑颍澹恚椋遥危粒罂梢酝ㄟ^(guò)內(nèi)??含子的直接剪接獨(dú)立于Ｄｍｓｈａ復(fù)合體進(jìn)行處理。接下來(lái)，Ｅｘｐ〇ｒｔｉｎ５通過(guò)識(shí)別??ｐｒｅ－ｍｉＲＮＡ?末端?２－３ｎｔ?懸垂雙鏈?ｓｔｅｍ?結(jié)構(gòu)，形成?Ｅｘｐｏｒｔｉｎ５－ＧＴＰ－ｐｒｅ－ｍｉＲＮＡ?復(fù)合體，??將其從細(xì)胞核轉(zhuǎn)運(yùn)至細(xì)胞質(zhì)。最后，在胞質(zhì)中ｐｒｅ－ｍｉＲＮＡｓ被ＲＮａｓｅＨＩ內(nèi)切酶Ｄｉｃｅｒ??切割成長(zhǎng)度大約為２２ｎｔ雙鏈ｍｉＲＮＡｓ。其中一條鏈，稱為引導(dǎo)ｍｉＲＮＡ，與ＲＮＡ誘??導(dǎo)沉默復(fù)合體（ＲＮＡ?ｉｎｄｕｃｅｄ?ｓｉｌｅｎｃｉｎｇ?ｃｏｍｐｌｅｘｅｓ，ＲＩＳＣ）

第二章?ｃｉｒｃ－ＲＨＯＪ．ｌ、ｍｉＲ－１２４－３ｐ與ＮＲＧ－１在心肌缺血再灌注損傷中的表達(dá)??２．３實(shí)驗(yàn)結(jié)果??２．３．１分離和鑒定大鼠心肌細(xì)胞??采取胰蛋白酶消化，差速貼壁離心法分離心肌細(xì)胞。顯微鏡下觀察心肌細(xì)??胞呈圓形或楠圓形。大約２４小時(shí)后，大部分心肌細(xì)胞已經(jīng)貼壁，細(xì)胞偽足逐漸??地延伸。貼壁細(xì)胞的形態(tài)不規(guī)則，多見多邊形和三角形的細(xì)胞。３天后，細(xì)胞??形成樹突連接的簇狀結(jié)構(gòu)（圖２－１Ａ）。細(xì)胞免疫熒光結(jié)果顯示，心肌肌鈣蛋白??（ｃＴｎＴ）表達(dá)水平高，主要定位于提取心肌細(xì)胞的細(xì)胞質(zhì)中，符合心肌細(xì)胞的??染色特征（圖２－１Ｂ）。??ＨＢｉｌｌｌ??Ｂ?ｃＴｎＴ?ＤＡＰＩ?Ｍｅｒｇｅｄ??ＳＭＢ??圖２－１．分離鑒別大鼠心肌細(xì)胞??Ｆｉｇｕｒｅ?２－１．?Ｉｓｏｌａｔｉｏｎ?ａｎｄ?ｉｄｅｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎ?ｏｆ?ｒａｔ?ｍｙｏｃａｒｄｉａｌ?ｃｅｌｌｓ．??Ａ，第１、２、３天分別在顯微鏡下觀察提取的大鼠心肌細(xì)胞形態(tài)。標(biāo)尺，５０，。??Ｂ，釆用免疫熒光法檢測(cè)提取的大鼠心肌細(xì)胞中ｃＴｎＴ的細(xì)胞定位和表達(dá)水平。??ｃＴｎＴ為綠色，細(xì)胞核為藍(lán)色（ＤＡＰＩ）。標(biāo)尺，ｌＯｆｉｍ。??３０??

【參考文獻(xiàn)】：
期刊論文
[1]脂質(zhì)載體前列腺素E1對(duì)大鼠心肌缺血-再灌注損傷的保護(hù)作用[J]. 王凌燕,蔡高軍,孫文偉,王文志.  中國(guó)實(shí)驗(yàn)診斷學(xué). 2006(03)



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