目的:擬對(duì)課題組前期發(fā)現(xiàn)的冠心病相關(guān)SLC22A3基因intron7區(qū)域中的2段DNA負(fù)性調(diào)控序列的性質(zhì)及功能進(jìn)行研究,以明確其為沉默子還是絕緣子。方法:利用生物信息學(xué)分析兩段負(fù)性調(diào)控序列在所培養(yǎng)細(xì)胞系中的脫氧核糖核酸酶I（DNaseI）敏感性,并以包含人SLC22A3基因全長(zhǎng)序列的細(xì)菌人工染色體（bacterial artificial chromosome,BAC）為模板,PCR擴(kuò)增兩負(fù)性調(diào)控序列,以pGL3-Control質(zhì)粒作為工具載體,將兩段序列克隆入報(bào)告基因Luciferase（LUC）的啟動(dòng)子與增強(qiáng)子之間以及增強(qiáng)子的下游,構(gòu)建4組重組質(zhì)粒,并以pGL3-Control質(zhì)粒作為空白對(duì)照,與內(nèi)參質(zhì)粒pRL-SV40共轉(zhuǎn)染人胚腎細(xì)胞HEK293T,24h后檢測(cè)熒光素酶活性。結(jié)果:兩段負(fù)性調(diào)控序列均位于DNaseⅠ超敏位點(diǎn),明確了其為順式調(diào)控元件的性質(zhì)。4組重組質(zhì)粒pGL3-con-SLCi7-447X、pGL3-con-SLCi7-447S、pGL3-con-SLCi7-460X以及pG L3-conSLCi7-460S熒光素酶活性分別為（2.353±0.323）、（3.046... 

【文章來源】：重慶醫(yī)科大學(xué)重慶市

【文章頁數(shù)】：44 頁

【學(xué)位級(jí)別】：碩士

【部分圖文】：

重組質(zhì)粒構(gòu)建示意圖

學(xué)分析使用統(tǒng)計(jì)軟件 SPSS 25.0 來分析數(shù)據(jù)，熒光素酶活性用 3準(zhǔn)差（x±s）表示，采用單因素方差分析（ANOVA），組當(dāng) P﹤0.05 時(shí)，認(rèn)為差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。性調(diào)控序列的 DNaseI 敏感性分析相關(guān) SLC22A3 基因 intron7 區(qū)域的兩段負(fù)性調(diào)控序列如圖 2、3 所示，均位于 DNaseⅠ超敏位點(diǎn)。明確了其順式調(diào)控元件中，具備負(fù)性調(diào)控作用的有絕緣子及沉默子，因的功能鑒定試驗(yàn)。DNa

注：X 軸表示 NO10.22 上下游各延伸 100bp 的基因片段（填充區(qū)域?yàn)?NO10.22 片段），Y 軸表示 DNase I-seq 信號(hào)強(qiáng)度圖 3 NO10.22 的 DNA 酶Ⅰ敏感性分析Fig.3 DNaseⅠhypersensitivity of NO10.22質(zhì)粒的構(gòu)建增兩目的序列所得產(chǎn)物 SLCi7-447-X、SLCi7-447-S、SLC-S 通過 1％瓊脂糖凝膠電泳后得到 447bp、447bp、460bp、純化回收后，分別克隆入 pGL3-Control 質(zhì)粒以構(gòu)建重組質(zhì)入啟 動(dòng)子 與增 強(qiáng)子之 間獲 得重組質(zhì)粒 pGL3-con-SLSLCi7-460X，插入增強(qiáng)子下游獲得重組質(zhì)粒 pGL3-con-SLSLCi7-460S；重組質(zhì)粒 pGL3-con-SLCi7-447X、pGL3-con-

【參考文獻(xiàn)】：
期刊論文
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博士論文
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本文編號(hào)：3071704