發(fā)布時間：2021-01-08 02:56

　　目的體外建立TNF-α誘導(dǎo)人臍靜脈內(nèi)皮細胞（HUVECs）損傷模型,研究RhoGTP酶在TNF-α誘導(dǎo)內(nèi)皮細胞損傷中的作用及機制。方法購買人臍靜脈內(nèi)皮細胞（HUVECs）貼壁培養(yǎng)。采用siRNA技術(shù)在HUVECs中分別沉默RhoA、Rac1、Cdc42的基因表達,通過RT-PCR法鑒定RhoA、Rac1、Cdc42的沉默。實驗采用正常組（control）、模型組（60 ng/ml TNF-α,作用4 h）,應(yīng)用Western Blot技術(shù)和Pulldown assay檢測RhoA、Rac1、Cdc42和Raf-1的表達及活化;采用正常組（control）、模型組（60 ng/ml TNF-α,作用4 h）、siRNA或抑制劑組、siRNA或抑制劑預(yù)處理+TNF-α處理組,應(yīng)用MTT法檢測細胞存活率,PI/Annexin V-FITC雙染色和流式細胞儀檢測細胞凋亡,應(yīng)用Western Blot技術(shù)檢測ROCK的表達、活化、vimentin（波形蛋白）的表達、裂解、磷酸化以及caspase3、caspase8、caspase9的活化,免疫熒光檢測vimentin和phospho-vimen... 

【文章來源】：南通大學(xué)江蘇省

【文章頁數(shù)】：81 頁

【學(xué)位級別】：碩士

【文章目錄】：
摘要
Abstract
第一章 緒論
第二章 材料與方法
    2.1 研究資料及儀器設(shè)備
        2.1.1 研究對象
        2.1.2 主要儀器與試劑
        2.1.3 主要溶液配制
    2.2 實驗流程與方法
        2.2.1 細胞培養(yǎng)與鑒定
        2.2.2 細胞凍存
        2.2.3 細胞復(fù)蘇
        2.2.4 實驗分組
        2.2.5 MTT法
        2.2.6 免疫熒光
        2.2.7 siRNA轉(zhuǎn)染
        2.2.8 RT-PCR分析
        2.2.9 蛋白樣品提取
        2.2.10 蛋白質(zhì)定量（BCA法）及配平
        2.2.11 Western Blot
        2.2.12 Pulldown assay
        2.2.13 Annexin V-FITC/PI凋亡檢測
        2.2.14 流式細胞儀BD Accuri C6日常操作流程
        2.2.15 統(tǒng)計學(xué)處理分析
第三章 結(jié)果
    3.1 內(nèi)皮細胞鑒定
    3.2 RhoA、Rac1、Cdc42沉默的篩選及鑒定
    3.3 RhoA沉默顯著降低TNF-α誘導(dǎo)的內(nèi)皮細胞毒性
        3.3.1 RhoA沉默顯著提高TNF-α誘導(dǎo)的內(nèi)皮細胞存活率
        3.3.2 RhoA沉默顯著降低TNF-α誘導(dǎo)的內(nèi)皮細胞凋亡
    3.4 TNF-α誘導(dǎo)Rho A活化，而對Rac1、Cdc42的活化無明顯作用
    3.5 RhoA沉默抑制TNF-α誘導(dǎo)ROCK1表達及ROCK活化
        3.5.1 RhoA沉默抑制TNF-α誘導(dǎo)ROCK1表達
        3.5.2 RhoA沉默抑制TNF-α誘導(dǎo)ROCK活化
    3.6 ROCK抑制可減少TNF-α誘導(dǎo)的內(nèi)皮細胞毒性
    3.7 RhoA/ROCK信號通路介導(dǎo)TNF-α誘導(dǎo)的Vimentin裂解和磷酸化
    3.8 ROCK抑制可減少TNF-α誘導(dǎo)的caspase3和caspase8的活化
    3.9 RhoA/ROCK信號通路介導(dǎo)TNF-α誘導(dǎo)的Vimentin和phospho-Vimentin的重排
    3.10 TNF-α可誘導(dǎo)Raf-1的磷酸化
    3.11 Raf-1抑制不影響ROCK1表達和ROCK活化
    3.12 Raf-1/CK2通路可介導(dǎo)TNF-α誘導(dǎo)的Vimentin和phospho-Vimentin表達，但不影響TNF-α誘導(dǎo)的Vimentin裂解
    3.13 Raf-1/CK2通路可介導(dǎo)TNF-α誘導(dǎo)的Vimentin和phospho-Vimentin的重排
    3.14 Raf-1/CK2通路可介導(dǎo)TNF-α誘導(dǎo)的內(nèi)皮細胞毒性
第四章 討論
第五章 結(jié)論
參考文獻
英文縮寫詞表
綜述
    綜述參考文獻
在攻讀碩士學(xué)位期間公開發(fā)表的論文與參加的項目
    A：在國內(nèi)外刊物上發(fā)表的論文
    B：所主持的項目
    C：所參與的項目
致謝


【參考文獻】：
期刊論文
[1]法舒地爾對急性缺血性腦卒中患者血液流變學(xué)的影響[J]. 張愛華,全正翔,劉福中.  中南藥學(xué). 2008(03)



本文編號：2963769