發(fā)布時(shí)間：2017-04-07 16:26

  本文關(guān)鍵詞：CD137分子對(duì)小鼠血管鈣化的影響，，由筆耕文化傳播整理發(fā)布。

【摘要】：目的探討CD137分子對(duì)載脂蛋白E基因敲除小鼠(Apo E-/-小鼠)動(dòng)脈粥樣斑塊及血管平滑肌細(xì)胞(vascular smooth muscle cells,VSMCs)鈣化的影響。方法本實(shí)驗(yàn)包括體內(nèi)實(shí)驗(yàn)和體外實(shí)驗(yàn)兩部分。(1)體內(nèi)實(shí)驗(yàn):Apo E-/-小鼠給予高脂飲食誘導(dǎo)動(dòng)脈粥樣硬化及鈣化模型,分別用刺激型CD137抗體、抑制型CD137抗體激活或抑制CD137分子。對(duì)各組小鼠主動(dòng)脈行組織形態(tài)學(xué)分析并予Masson染色及ALP染色,用Von kossa染色比較各組斑塊鈣化程度、免疫組化染色檢測(cè)斑塊中骨形成蛋白-2(Bone morphogenetic protein 2,BMP-2)及Runx2蛋白表達(dá)水平。(2)體外實(shí)驗(yàn):采用組織塊貼壁法分離、培養(yǎng)C57BL/6J小鼠主動(dòng)脈VSMCs,免疫熒光染色鑒定細(xì)胞純度;用β-甘油磷酸鈉誘導(dǎo)VSMCs鈣化,以刺激型CD137抗體、抑制型CD137抗體激活或抑制CD137分子;細(xì)胞鈣化及細(xì)胞內(nèi)鈣離子含量分別采用von kossa染色和甲基百里香酚藍(lán)法檢測(cè),采用實(shí)時(shí)熒光定量PCR(RT-PCR)檢測(cè)各組VSMCs骨形成相關(guān)蛋白BMP-2和Runx2m RNA的表達(dá)水平、蛋白印跡法(Western blot)檢測(cè)BMP-2、Runx2蛋白表達(dá)水平。結(jié)果(1)各組內(nèi)均可見(jiàn)小鼠主動(dòng)脈內(nèi)膜增厚及粥樣斑塊形成。給予刺激型CD137抗體激活CD137分子后,小鼠粥樣斑塊及鈣化面積增加,血管壁肌纖維減少,斑塊內(nèi)見(jiàn)大量圓形或橢圓形、胞質(zhì)嗜堿性的骨樣細(xì)胞生成;而同時(shí)給予抑制型CD137抗體可部分逆轉(zhuǎn)這種現(xiàn)象。(2)ALP染色結(jié)果顯示,ALP在鈣鹽沉積部位活性較高,CD137刺激組斑塊內(nèi)ALP活性較對(duì)照組明顯升高;而CD137抑制組斑塊內(nèi)ALP活性較刺激組下降。(3)免疫組織化學(xué)染色結(jié)果顯示,對(duì)照組粥樣斑塊中BMP-2、Runx2表達(dá)較低;CD137刺激組BMP-2和Runx2的表達(dá)顯著增加;而CD137抑制組BMP-2、Runx2的表達(dá)量與CD137刺激組相比有所下降。(4)組織塊貼壁法分離、培養(yǎng)的小鼠VSMCs可見(jiàn)“谷峰樣”生長(zhǎng);第3代細(xì)胞經(jīng)免疫熒光鑒定其純度達(dá)95%。(5)VSMCs經(jīng)刺激型CD137抗體處理后,VSMCs的鈣化較對(duì)照組而言明顯加重;而經(jīng)過(guò)額外的抑制型CD137抗體預(yù)處理后,刺激型CD137抗體的這種加強(qiáng)VSMCs鈣化的作用被削弱。(6)CD137刺激組VSMCs鈣含量和ALP活性較對(duì)照組增加(分別為P0.01,P0.05),而CD137抑制組VSMCs鈣含量、ALP活性較刺激組均下降(分別為P0.01,P0.05)。(7)刺激型CD137抗體處理VSMCs后,細(xì)胞內(nèi)BMP-2、Runx2的m RNA及蛋白表達(dá)水平較對(duì)照組升高;予抑制型CD137抗體預(yù)處理后,BMP-2、Runx2m RNA及蛋白表達(dá)水平較刺激組下降。結(jié)論(1)激活CD137能夠促進(jìn)Apo E-/-小鼠粥樣斑塊及VSMCs鈣化;(2)CD137可參與調(diào)節(jié)VSMCs向骨樣細(xì)胞表型轉(zhuǎn)化。
【關(guān)鍵詞】：CD137 血管鈣化 血管平滑肌細(xì)胞 表型轉(zhuǎn)化 動(dòng)脈粥樣硬化
【學(xué)位授予單位】：江蘇大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2016
【分類(lèi)號(hào)】：R543.5
【目錄】：

• 摘要5-7
• Abstract7-12
• 常用縮略語(yǔ)中英文對(duì)照表12-14
• 第一章 緒論14-21
• 1.1 研究背景14-19
• 1.1.1 動(dòng)脈粥樣硬化的發(fā)生和發(fā)展14-15
• 1.1.2 血管鈣化與動(dòng)脈粥樣硬化15-17
• 1.1.3 炎癥在血管鈣化形成中的作用17-18
• 1.1.4 CD137研究現(xiàn)狀18-19
• 1.2 本研究的目的意義19
• 1.3 主要研究?jī)?nèi)容和技術(shù)路線(xiàn)19-21
• 1.3.1 研究?jī)?nèi)容19-20
• 1.3.2 技術(shù)路線(xiàn)圖20-21
• 第二章 CD137對(duì)ApoE~(-/-)小鼠粥樣斑塊鈣化的影響21-32
• 2.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物和材料21-22
• 2.1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物及飼料21
• 2.1.2 實(shí)驗(yàn)試劑及其配制21-22
• 2.1.3 實(shí)驗(yàn)儀器22
• 2.2 實(shí)驗(yàn)方法22-26
• 2.2.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物飼養(yǎng)22
• 2.2.2 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物分組及處理22-23
• 2.2.3 組織收集與切片制備23-24
• 2.2.4 蘇木精&伊紅染色（H&E染色）24
• 2.2.5 Masson三色染色24
• 2.2.6 Von kossa染色24-25
• 2.2.7 ALP染色25
• 2.2.8 免疫組織化學(xué)染色25-26
• 2.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析方法26
• 2.4 實(shí)驗(yàn)結(jié)果26-30
• 2.4.1 干預(yù)CD137后ApoE~(-/-)小鼠主動(dòng)脈組織形態(tài)學(xué)變化26
• 2.4.2 干預(yù)CD137對(duì)ApoE~(-/-)小鼠主動(dòng)脈粥樣斑塊鈣化的影響26-27
• 2.4.3 干預(yù)CD137后ApoE~(-/-)小鼠主動(dòng)脈管壁肌纖維分布變化27-28
• 2.4.4 干預(yù)CD137后ApoE~(-/-)小鼠主動(dòng)脈ALP表達(dá)及分布28
• 2.4.5 干預(yù)CD137對(duì)ApoE~(-/-)小鼠主動(dòng)脈BMP-2、Runx2表達(dá)的影響28-30
• 2.5 討論30-32
• 第三章 CD137對(duì)小鼠血管平滑肌細(xì)胞鈣化的影響32-47
• 3.1 材料32-34
• 3.1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物32
• 3.1.2 試劑及耗材32-34
• 3.2 實(shí)驗(yàn)方法34-41
• 3.2.1 小鼠主動(dòng)脈VSMCs分離、培養(yǎng)及鑒定34-35
• 3.2.2 細(xì)胞處理及分組35
• 3.2.3 Von kosssa染色35-36
• 3.2.4 細(xì)胞內(nèi)鈣離子含量定量測(cè)試36
• 3.2.5 VSMCs上清液堿性磷酸酶（ALP）活性測(cè)定36-37
• 3.2.6 RT-PCR檢測(cè)目的基因mRNA表達(dá)水平37-39
• 3.2.7 細(xì)胞蛋白提取及免疫印跡（Western blot）39-41
• 3.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法41-42
• 3.4 結(jié)果42-45
• 3.4.1 VSMCs鑒定42
• 3.4.2 干預(yù)CD137對(duì)VSMCs鈣化的影響42-43
• 3.4.3 干預(yù)CD137對(duì)VSMCs鈣含量及ALP活性的影響43
• 3.4.4 干預(yù)CD137對(duì)VSMCs骨形成相關(guān)基因表達(dá)的影響43-44
• 3.4.5 干預(yù)CD137對(duì)VSMCs骨形成相關(guān)蛋白表達(dá)的影響44-45
• 3.5 討論45-47
• 第四章 結(jié)論47-48
• 參考文獻(xiàn)48-52
• 綜述52-66
• 參考文獻(xiàn)61-66
• 致謝66-67
• 在學(xué)期間發(fā)表的學(xué)術(shù)論文67

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