目的:通過(guò)體外培養(yǎng)H9c2大鼠心肌細(xì)胞并建立缺氧復(fù)氧模型,觀察不同缺氧復(fù)氧損傷程度對(duì)H9c2心肌細(xì)胞自噬的影響,并觀察自噬變化對(duì)心肌細(xì)胞存活率的影響,探討當(dāng)前實(shí)驗(yàn)條件下研究H9c2心肌細(xì)胞自噬最佳的缺氧復(fù)氧模型;以選擇性κ-阿片受體激動(dòng)劑U50488H預(yù)處理作為干預(yù),觀察κ-阿片類(lèi)物質(zhì)對(duì)缺氧復(fù)氧損傷H9c2心肌細(xì)胞存活率及自噬的影響,探討H9c2心肌細(xì)胞缺氧復(fù)氧過(guò)程中κ阿片受體的激活是否具有直接的心肌細(xì)胞保護(hù)效應(yīng)以及自噬是否參與其中并發(fā)揮作用。方法:培養(yǎng)H9c2大鼠心肌細(xì)胞,利用不同缺氧液建立不同損傷程度的缺氧復(fù)氧模型,缺氧時(shí)將H9c2細(xì)胞置于缺氧培養(yǎng)箱,分別以0.5%FBS復(fù)合高糖DMEM、無(wú)糖培養(yǎng)基、PBS緩沖鹽溶液為缺氧液培養(yǎng)3h后置換完全培養(yǎng)基置于正常培養(yǎng)箱中培養(yǎng)3h,觀察不同缺氧復(fù)氧損傷程度對(duì)H9c2心肌細(xì)胞形態(tài)的影響,MTT法檢測(cè)各組細(xì)胞存活率,MDC熒光染色流式細(xì)胞儀檢測(cè)各組細(xì)胞自噬率,實(shí)時(shí)熒光定量PCR法檢測(cè)各組細(xì)胞內(nèi)Atg5 mRNA的表達(dá)水平;給予濃度分別為0.1 u mol/L、1 u mol/L、10 μ mol/L的U50488H預(yù)處理H9c2心肌細(xì)胞24h后建立以0.5%FBS復(fù)合高糖DMEM為缺氧液缺氧3h復(fù)氧3h的缺氧復(fù)氧模型,取復(fù)氧后心肌細(xì)胞,MTT法檢測(cè)各組細(xì)胞存活率,MDC熒光染色流式細(xì)胞儀檢測(cè)細(xì)胞自噬率,實(shí)時(shí)熒光定量PCR法檢測(cè)細(xì)胞內(nèi)Atg5 mRNA的表達(dá)水平。結(jié)果:建立H9c2大鼠心肌細(xì)胞不同損傷程度缺氧復(fù)氧模型的研究中,與空白對(duì)照組相比,各H/R模型組細(xì)胞存活率均降低,0.5%FBS復(fù)合高糖DMEM、無(wú)糖培養(yǎng)基、PBS處理各組H/R心肌細(xì)胞存活率逐漸下降。流式細(xì)胞儀與實(shí)時(shí)熒光定量PCR的結(jié)果顯示,與空白對(duì)照組相比,各H/R模型組心肌細(xì)胞自噬率與Atg5 mRNA的表達(dá)差別均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義;0.5%FBS復(fù)合高糖DMEM、無(wú)糖培養(yǎng)基、PBS處理各組H/R心肌細(xì)胞自噬率與Atg5 mRNA的表達(dá)均逐漸下降,其中0.5%FBS復(fù)合高糖DMEM、無(wú)糖培養(yǎng)基處理組較空白對(duì)照組增加,PBS處理組則是下降的。U50488H預(yù)處理缺氧復(fù)氧損傷H9c2大鼠心肌細(xì)胞的研究中,與空白對(duì)照組相比,H/R組和U50488H各濃度處理組細(xì)胞存活率均降低;與H/R組相比U50488H各濃度處理組細(xì)胞存活率差別均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。流式細(xì)胞儀與實(shí)時(shí)熒光定量PCR的結(jié)果顯示,與空白對(duì)照組相比,H/R組和U50488H各濃度預(yù)處理組心肌細(xì)胞自噬率以及Atg5 mRNA的表達(dá)均上調(diào);與H/R組相比,U50488H 0.1μmol/L預(yù)處理組心肌細(xì)胞自噬率和Atg5 mRNA的表達(dá)差別均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義,U50488H 1 u mol/L預(yù)處理組心肌細(xì)胞自噬率差別無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義,Atg5 mRNA的表達(dá)差別則有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義,U50488H110 μ mol/L預(yù)處理組心肌細(xì)胞自噬率與Atg5 mRNA的表達(dá)差別均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。結(jié)論:利用缺氧培養(yǎng)箱選用0.5%FBS復(fù)合高糖DMEM或者無(wú)糖培養(yǎng)基作為缺氧液均可建立可行的研究H9c2心肌細(xì)胞自噬的缺氧復(fù)氧模型,心肌細(xì)胞的自噬水平與缺氧復(fù)氧損傷的程度相關(guān),適度缺血缺氧可激活自噬,而過(guò)度則可抑制自噬。選擇性κ-阿片受體激動(dòng)劑U50488H預(yù)處理呈濃度依賴(lài)性升高缺氧復(fù)氧損傷H9c2心肌細(xì)胞的自噬水平,對(duì)細(xì)胞存活率沒(méi)有明顯影響,提示細(xì)胞存活可能受多種因素影響,需要進(jìn)一步研究。
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