研究背景:肺動脈平滑肌細胞的過度增殖、凋亡抵抗以及異常遷移是肺動脈高壓肺動脈血管重塑的標(biāo)志性特點。研究顯示W(wǎng)nt/β-catenin信號通路在肺動脈高壓的肺動脈平滑肌細胞增殖中起關(guān)鍵作用。氯硝柳胺是一種廣泛應(yīng)用的抗絳蟲感染的藥物,在臨床上的應(yīng)用已經(jīng)超過50余年,研究顯示氯硝柳胺在治療腫瘤中顯示出多種多樣的抗腫瘤生物學(xué)功能,包括抑制腫瘤細胞的增殖和遷移,誘導(dǎo)腫瘤細胞凋亡,氯硝柳胺可影響腫瘤細胞中的多種信號通路,如Wnt/β-catenin、P53信號通路,誘導(dǎo)、增加活性氧產(chǎn)生進而誘導(dǎo)凋亡等。氯硝柳胺是否可抑制肺動脈平滑肌細胞的增殖、遷移及誘導(dǎo)凋亡尚不清楚,因此,本研究探究了氯硝柳胺對肺動脈平滑肌細胞的增殖、遷移及凋亡的作用及其可能的機制。研究方法:氯硝柳胺(0-5μM)分別處理肺動脈平滑肌細胞12 h、24 h、48 h后,應(yīng)用CCK-8增殖實驗研究氯硝柳胺對肺動脈平滑肌細胞增殖的影響;EdU增殖實驗檢測氯硝柳胺對肺動脈平滑肌細胞DNA合成的影響;應(yīng)用劃痕實驗檢測對肺動脈平滑肌細胞遷移的影響。采用Hoechst凋亡染色以及Annexin V-FITC流式細胞儀檢測氯硝柳胺對肺動脈平滑肌細胞凋亡的誘導(dǎo)作用,流式細胞儀檢測其對肺動脈平滑肌細胞的細胞周期的影響,以及肺動脈平滑肌活性氧產(chǎn)生的影響;采用熒光顯微鏡及流式細胞儀分析檢測肺動脈平滑肌細胞線粒體膜電位,以明確氯硝柳胺是否通過影響細胞中活性氧的產(chǎn)生、線粒體膜電位而影響凋亡,采用Western blot實驗分析氯硝柳胺對肺動脈平滑肌細胞中的cycLin D1蛋白表達,Western blot檢測肺動脈平滑肌細胞中凋亡相關(guān)蛋白表達,包括caspase-3、caspase-9、Bax、Cytochrome c、p53,Western blot檢測Wnt/β-catenin信號通路蛋白表達水平,包括β-catenin、Wnt5a、DVL2、DVL3、Axin1、P-LRP6。研究結(jié)果:氯硝柳胺處理12 h、24 h、48 h可抑制肺動脈平滑肌細胞的增殖。EdU增殖實驗發(fā)現(xiàn)氯硝柳胺處理24 h后可影響肺動脈平滑肌細胞的DNA合成,對照組EdU陽性細胞百分比為(9.8±0.7)%,0.3μM氯硝柳胺處理組EdU陽性細胞百分比為(3.4±0.7)%,處理組EdU陽性細胞百分比下降了65%。氯硝柳胺可抑制肺動脈平滑肌細胞的遷移。氯硝柳胺可導(dǎo)致肺動脈平滑肌細胞周期紊亂,對照組G0/G1期細胞百分比為(61.98±1.04)%,S期細胞百分比為(27.08±2.88)%,處理組G0/G1期細胞百分比為(72.85±0.52)%,S期細胞百分比為(14.26±1.23)%。氯硝柳胺處理組肺動脈平滑肌細胞的凋亡水平增高。氯硝柳胺處理組肺動脈平滑肌細胞活性氧產(chǎn)生增加。氯硝柳胺處理組肺動脈平滑肌細胞的線粒體膜電位無顯著影響。氯硝柳胺導(dǎo)致肺動脈平滑肌細胞中的cycLin D1蛋白表達水平降低。氯硝柳胺可導(dǎo)致肺動脈平滑肌細胞中的caspase-3、caspase-9、Bax、Cytochrome c、p53蛋白表達升高。氯硝柳胺可抑制肺動脈平滑肌細胞中的β-catenin、Wnt5a、DVL2、DVL3、Axin1、P-LRP6蛋白表達。結(jié)論:氯硝柳胺可抑制肺動脈平滑肌細胞的增殖、遷移并誘導(dǎo)凋亡;氯硝柳胺誘導(dǎo)肺動脈平滑肌細胞凋亡與p53信號通路的激活及活性氧的產(chǎn)生有關(guān),與影響線粒體膜電位來誘導(dǎo)凋亡的機制無關(guān);氯硝柳胺對肺動脈平滑肌細胞的抗增殖作用與誘導(dǎo)細胞周期阻滯在G0/G1期及抑制Wnt/β-catenin信號通路、cycLin D1蛋白表達有關(guān)。
【學(xué)位單位】：中國人民解放軍海軍軍醫(yī)大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位年份】：2019
【中圖分類】：R544.1
【部分圖文】：

圖 1.肺動脈高壓中肺血管細胞增殖中涉及的信號通路[Pulmonary Circulation 2017; 7:285-299]在尋找新的靶分子治療肺動脈高壓的過程中，可以通過在治療腫瘤中的藥物入手，尤其是那些在臨床上應(yīng)用實踐有比較長的時間、臨床應(yīng)用資料較全的藥物，因而其安全性可能較高，同樣的，相比新藥的研發(fā)、應(yīng)用需要一個漫長周期，且需耗費大量的資金，從現(xiàn)有的抗腫瘤藥物中尋找藥物具有較高的性價比。有學(xué)者發(fā)現(xiàn)，伊馬替尼作為一種治療慢性粒細胞白血病的藥物，被發(fā)現(xiàn)可緩解野百合堿誘導(dǎo)的肺動脈高壓[8]。有沒有其他的藥物具有類似伊馬替尼的效果能夠干預(yù)肺動脈高壓呢？本研究通過查閱資料，最終本研究發(fā)現(xiàn)氯硝柳胺可能具有潛在、類似的作用，氯硝柳胺（nicolsamide）又稱滅絳靈，臨床上作為抗寄生蟲病中的驅(qū)絳蟲藥物已經(jīng)應(yīng)用50 余年；文獻顯示氯硝柳胺具有高效、毒性低的特點，是目前大面積使用的滅釘螺的有效藥物，通過影響細胞線粒體功能而起效[9]。而近年來，越來越多的研究顯示氯硝柳胺具有抗腫瘤作用，抑制腫瘤細胞的增殖、遷移，誘導(dǎo)凋亡。研究顯示，氯硝柳胺可抑制前列腺癌細胞、肺癌細胞的遷移[10, 11]。此外，研究顯示，氯硝柳胺可抑制結(jié)腸癌細胞的增殖、遷移，并誘導(dǎo)凋亡，同時抑制結(jié)腸癌細胞中的 Notch1、

氯硝柳胺對肺動脈平滑肌細胞增殖、遷移的影響及機制 Wnt/β-catenin 信號通路有關(guān)，而且氯硝柳胺可誘導(dǎo)腎癌細胞線粒體膜電及活性氧產(chǎn)生的增加[14]。氯硝柳胺可通過干預(yù)結(jié)腸癌細胞中 Wnt/β-cateni而抑制細胞增殖[15]。氯硝柳胺可抑制乳腺癌細胞中的 Wnt/β-catenin 信號通其增殖[16]。氯硝柳胺可干預(yù)腫瘤細胞中中多條信號通路來干預(yù)增殖[17]（

treated with different concentrations of niclosamide for 24 hours.氯硝柳胺 0 0.3 M 0.6 M 1.2 M 2.5 M 5 M均值 1.02 0.89 0.73 0.64 0.85 0.50標(biāo)準(zhǔn)差 0.07 0.12 0.07 0.03 0.48 0.04表 3.肺動脈平滑肌細胞經(jīng)不同濃度氯硝柳胺處理 48 h 后 CCK-8 檢測測得的吸光度值。Table3.Absorbance values measured by CCK-8 after pulmonary artery smooth muscle cells weretreated with different concentrations of niclosamide for 48 hours.氯硝柳胺 0 0.3 M 0.6 M 1.2 M 2.5 M 5 M均值 1.34 0.77 0.56 0.47 0.46 0.42標(biāo)準(zhǔn)差 0.10 0.04 0.05 0.03 0.04 0.01
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本文編號：2892976