背景及目的伴隨著我國(guó)城市化進(jìn)程加快并且步入老齡化社會(huì),以及廣大居民生活方式不健康,2017年中國(guó)心血管病報(bào)告中指出我國(guó)心血管患者超過(guò)二億九千萬(wàn),心血管病死亡率已超過(guò)癌癥成為第一致死性疾病。其中心肌梗死死亡率占心血管病死亡60%以上,并且總體呈上升態(tài)勢(shì)。心肌梗死(myocardial infarction,MI)是冠狀動(dòng)脈粥樣斑塊破裂形成血栓,冠狀動(dòng)脈管腔梗塞,心肌持續(xù)缺血、缺氧導(dǎo)致壞死的臨床綜合征。治療手段可以分為藥物治療和再血管化治療。不管何種治療手段都與梗死心肌血供恢復(fù)狀況密切相關(guān),因此梗死心肌中新生血管形成多少或原有阻塞血管重新開(kāi)放,對(duì)于心肌梗死的修復(fù)具有重要的意義。血管的生成是指通過(guò)血管內(nèi)皮細(xì)胞的增殖和遷移,以出芽或套迭的方式生成新的血管。近些年隨著對(duì)MI過(guò)程中病理生理改變的研究不斷深入,許多學(xué)者想到提高梗死區(qū)新生毛細(xì)血管的生成治療MI。近年來(lái),有關(guān)微小RNA的研究已經(jīng)成為醫(yī)學(xué)領(lǐng)域的研究熱點(diǎn)并取得了重要進(jìn)展。微小RNA(microRNA,miRNA)是真核生物中一類內(nèi)源性高度保守的非編碼小分子RNA,可以使目標(biāo)基因表達(dá)增強(qiáng)或抑制。研究報(bào)道m(xù)iRNA作用于機(jī)體各種生物反應(yīng)過(guò)程,其中就包括促進(jìn)血管新生,具有重要的生理和病理意義。miR-126是具有內(nèi)皮特異性的miRNA,在所有毛細(xì)血管和較大的血管內(nèi)皮細(xì)胞中高度表達(dá),通過(guò)影響血管基因信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路來(lái)調(diào)節(jié)血管的生成和發(fā)育。有研究證實(shí)miR-126是血管內(nèi)皮細(xì)胞中表達(dá)最豐富的miRNA,特別是在心臟、肺等高度血管化的小鼠組織中。miR-126在維持體內(nèi)血管內(nèi)皮細(xì)胞和血管完整性方面具有十分積極的作用。低能激光照射療法(low level laser irradiation,LLLI)是一種十分成熟的物理治療手段,在醫(yī)學(xué)方面的應(yīng)用已經(jīng)有40多年的歷史,起初在眼科、骨科領(lǐng)域率先大膽嘗試,現(xiàn)已經(jīng)在幾乎所有學(xué)科領(lǐng)域中廣泛應(yīng)用,它的安全性和有效性已經(jīng)得到學(xué)術(shù)界的證實(shí)和認(rèn)可。LLLI產(chǎn)生生物學(xué)效應(yīng)而非熱效應(yīng),包括刺激、調(diào)節(jié)、活化等生物刺激效應(yīng)。它主要影響損傷組織,對(duì)受損細(xì)胞有益,包括細(xì)胞增殖、粘附改善和防止細(xì)胞凋亡,對(duì)未受損細(xì)胞基本無(wú)害。盡管LLLI具體作用機(jī)制和作用機(jī)理還處于研究階段,但大量的基礎(chǔ)研究和臨床案例已經(jīng)證實(shí)其能在體外調(diào)節(jié)細(xì)胞和組織的諸多生物學(xué)過(guò)程。有研究顯示,LLLI能改善了梗死區(qū)域的微循環(huán),具有心肌保護(hù)作用,還能減弱膠原纖維的形成,改善心室重塑過(guò)程。因此,本研究通過(guò)建立大鼠心肌梗死模型,觀察心肌梗死前后心肌組織中miR-126表達(dá)的變化,并采用低能激光照射心梗區(qū)域,觀察梗死心肌邊緣組織中miR-126照射前后表達(dá)的變化,以及梗死后新生毛細(xì)血管密度的變化,進(jìn)而探討低能激光和miR-126是否能共同促進(jìn)毛細(xì)血管的生成,低能激光應(yīng)用于臨床治療心肌梗死提出可能。材料和方法(1)動(dòng)物及分組實(shí)驗(yàn)動(dòng)物為SPF級(jí)雄性SD大鼠110只,體重體重220-250g,年齡6-8周。隨機(jī)分為3組:假手術(shù)組30只、對(duì)照組40只、激光組40只。對(duì)照組和激光組大鼠建立心梗動(dòng)物模型,心梗模型建模方法為將左冠狀動(dòng)脈前降支結(jié)扎。假手術(shù)組制作方法為術(shù)中相同位置穿線但不結(jié)扎,余步驟相同。(2)篩選心梗模型大鼠心梗模型建模手術(shù)完成24h后,行超聲心動(dòng)圖檢測(cè),心梗模型的入選標(biāo)準(zhǔn):客觀指標(biāo):1.左室射血分?jǐn)?shù)60%;2.左室短軸縮短率30%;主觀指標(biāo):3.發(fā)現(xiàn)至少有1個(gè)層面表現(xiàn)出心室壁收縮異常。成功的心梗模型需符合2項(xiàng)及以上。(3)低能激光照射篩選后,對(duì)所有大鼠進(jìn)行LLLI。當(dāng)假手術(shù)組和對(duì)照組進(jìn)行LLLI時(shí),低能激光儀不通電。(4)左心功能檢查在大鼠心梗模型篩選時(shí)第1次記錄,對(duì)照組和激光組LLLI后,在獲取心肌組織標(biāo)本前再次行超聲心動(dòng)圖檢查,檢查指標(biāo)及方法均與第1次相同。(5)測(cè)定miR-126表達(dá)三組均在低能激光照射后24h、7d、14d時(shí)腹腔麻醉,迅速開(kāi)胸獲取標(biāo)本,排出心腔內(nèi)血液,確保無(wú)殘留,用眼科剪小心采集梗死區(qū)邊緣心肌組織,保存于-80℃冰箱。采用RT-qPCR方法檢測(cè)miR-126的表達(dá)。(6)梗死心肌組織病理分析三組大鼠在低能激光照射后7d時(shí)腹腔麻醉,迅速開(kāi)胸獲取標(biāo)本,用2%TTC磷酸緩沖液進(jìn)行染色(2-3只/組)、蘇木素-伊紅染色、CD31免疫組化法檢測(cè)MVD。(7)統(tǒng)計(jì)學(xué)方法實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)應(yīng)用SPSS 21.0統(tǒng)計(jì)軟件,計(jì)量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(x±s)表示析,采用方差分析證明各組方差齊性后采用LSD-t檢驗(yàn),計(jì)量資料相關(guān)性進(jìn)行關(guān)聯(lián)性分析,檢驗(yàn)水準(zhǔn)α=0.05,p0.05說(shuō)明差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。結(jié)果(1)大鼠建模情況在三組大鼠行建模操作后24h內(nèi),共有99只大鼠存活,假手術(shù)組29只,對(duì)照組30只,激光組35只,建模手術(shù)成功率為81.25%(65/80)。經(jīng)篩選,對(duì)照組有28只符合標(biāo)準(zhǔn),激光組有26只符合標(biāo)準(zhǔn),心梗模型建立成功率為:67.5%(54/80)。(2)左心功能評(píng)價(jià)及比較激光組低能激光照射7d后,照射后較照射前左室射血分?jǐn)?shù)、左室短軸縮短率顯著提高,差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義;低能激光照射7d后激光組較對(duì)照組左室射血分?jǐn)?shù)、左室短軸縮短率顯著提高,差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。(3)梗死心肌miR-126表達(dá)miR-126擴(kuò)增結(jié)果示:激光組miR-126的表達(dá)較對(duì)照組明顯增高。假手術(shù)組miR-126的表達(dá)不隨時(shí)間推移而改變,總體相對(duì)穩(wěn)定。在低能激光照射后,對(duì)照組和激光組miR-126的表達(dá)在24h、7d、14d均低于假手術(shù)組,而激光組均高于對(duì)照組;對(duì)照組miR-126表達(dá)在7d時(shí)最高,激光組同樣如此;對(duì)照組14d時(shí)miR-126的表達(dá)量低于24h,但激光組14d時(shí)與24h比較無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。(4)心梗面積比較根據(jù)TTC染色結(jié)果,發(fā)現(xiàn)激光組大鼠心梗面積與對(duì)照組相比顯著減少,差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。(5)心肌組織病理學(xué)檢測(cè)結(jié)果1.HE染色結(jié)果假手術(shù)組大鼠心肌細(xì)胞排列規(guī)整,細(xì)胞結(jié)構(gòu)基本正常,未見(jiàn)炎性細(xì)胞浸潤(rùn);對(duì)照組出現(xiàn)大量區(qū)域性壞死伴有大量炎性細(xì)胞浸潤(rùn);激光組心肌細(xì)胞壞死程度和水腫現(xiàn)象較對(duì)照組有所改善,炎性細(xì)胞浸潤(rùn)減少。2.免疫組化檢測(cè)結(jié)果CD31免疫組化法檢測(cè)大鼠梗死心肌組織中微血管密度(MVD),結(jié)果顯示:激光組大鼠心肌組織中微血管密度較對(duì)照組有明顯增加,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。(6)激光組miR-126表達(dá)與微血管密度的相關(guān)性激光組大鼠梗死心肌組織中miR-126的表達(dá)水平與微血管密度關(guān)聯(lián)性分析,結(jié)果示:激光組大鼠梗死心肌組織MVD與miR-126的表達(dá)水平呈正相關(guān)。結(jié)論低能激光能夠促進(jìn)大鼠心肌梗死后梗死心肌組織的血管再生,新生血管形成后,提升梗死心肌的血供,縮小了心肌梗死面積,減輕梗死過(guò)程中的炎性反應(yīng),提高左心功能,達(dá)到心肌保護(hù)的目的。低能激光可以提高梗死心肌中miRNA-126表達(dá),其與血管新生呈正相關(guān),這可能是低能激光影響血管再生的作用機(jī)制。
【學(xué)位單位】：鄭州大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位年份】：2019
【中圖分類】：R542.22
【部分圖文】：

3 結(jié)果.1 大鼠心肌梗死模型建立情況在大鼠心梗模型手術(shù)后 24h 內(nèi)，共有 99 只大鼠存活，其中假手術(shù)組存活，對(duì)照組存活 30 只，激光組存活 35 只，分析死亡原因?yàn)椋汉粑ソ咧伦灾鞑荒芑謴?fù)、結(jié)扎位置過(guò)高造成心梗面積過(guò)大致急性左心衰、搬動(dòng)心臟過(guò)多動(dòng)輕柔致惡性心律失常、術(shù)后恢復(fù)期肺部感染等。心梗模型建立過(guò)程中手術(shù)成為 81.25％（65/80）。經(jīng)超聲篩選，對(duì)照組有 28 只符合標(biāo)準(zhǔn)，激光組有 26合標(biāo)準(zhǔn)，心梗模型建立成功率為：67.5％（54/80）。術(shù)中結(jié)扎 LAD 后可見(jiàn)部位以下左心室部分心肌顏色變淡，微微發(fā)白（圖 3.1）。

13圖 3.2 低能激光照射后 7d 對(duì)照組和激光組 PCR 擴(kuò)增結(jié)果miR-126 擴(kuò)增情況：激光組 miR-126 表達(dá)高于對(duì)照組（見(jiàn)圖 3.2）3.3.2 miR-126 實(shí)時(shí)熒光定量 PCR 結(jié)果假手術(shù)組 miR-126 的表達(dá)不隨時(shí)間推移而改變，總體相對(duì)穩(wěn)定。在低能激光照射后，對(duì)照組和激光組 miR-126 的表達(dá)在 24h、7d、14d 均低于假手術(shù)組（24h假手術(shù)組比對(duì)照組 T=12.034 P=0.000，假手術(shù)組比激光組 T=8.045 P=0.000；7d假手術(shù)組比對(duì)照組 T=7.998 P=0.000，假手術(shù)組比激光組 T=2.585 P=0.049；14d假手術(shù)組比對(duì)照組 T=7.981 P=0.000，假手術(shù)組比激光組 T=4.533 P=0.006），而激光組均高于對(duì)照組（24h 激光組比對(duì)照組 T=3.076 P=0.028，7d 激光組比對(duì)照組 T=2.769 P=0.039，14d 激光組比對(duì)照組 T=10.509 P=0.000）；對(duì)照組 miR-126表達(dá)在 7d 時(shí)最高（對(duì)照組 7d 比對(duì)照組 24h T=7.809 P=0.001，對(duì)照組 7d 比對(duì)照組 14d T=9.182 P=0.000），激光組同樣如此（激光組 7d 比激光組 24h T=5.615P=0.002，激光組 7d 比激光組 14d T=27.336 P=0.000）；對(duì)照組 14d 時(shí) miR-126

表達(dá)量低于 24h，但激光組 14d 時(shí)與 24h 比較無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（對(duì)照組 14d 比對(duì)組 24h T=2.779 P=0.039，激光組 14d 比激光組 24h T=0.635 P=0.553）（見(jiàn)表.1 圖 3.3）。 3.1 各組大鼠梗死心肌 miR -126 在 LLLI 后不同時(shí)段的相對(duì)表達(dá)水平比較（n=6/時(shí)間點(diǎn)組別 24h 7d 14d假手術(shù)組 19.25±1.43 19.98±1.75 20.25±2.42對(duì)照組 12.42±1.01 15.58±0.83 11.15±0.98激光組 14.00±0.86 17.40±1.16 14.43±1.30
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