心血管疾病是在全世界死亡率和發(fā)病率最高的一個(gè)疾病之一。在我國(guó)，肥胖和高血壓人口達(dá)2億6千萬(wàn)，每年有300萬(wàn)人死于心腦血管疾病，尤其是動(dòng)脈粥樣硬化。我國(guó)居民攝食油脂較高，遠(yuǎn)超過(guò)了營(yíng)養(yǎng)學(xué)會(huì)推薦的水平。氫化油做為食品加工中常用的油脂，其中反式脂肪酸的含量較高。研究表明，高TFAs攝入除了通過(guò)升高血清LDL和TG，引起血管內(nèi)皮損傷外，還可提高可溶性細(xì)胞間黏附分子－1（SICAM-1）、可溶性血管細(xì)胞黏附分子－1（SVCAM-1）和E－選擇素（E-selectin）的表達(dá)。雖然有很多研究都報(bào)道了TFAs與心血管疾病有關(guān)系，但TFAs對(duì)血管的影響機(jī)制尚不清楚。有學(xué)者發(fā)現(xiàn)廣泛存在于中國(guó)日常膳食中的反油酸（9t18:1）和反亞油酸（9t12t18:2）能通過(guò)Caspase途徑誘導(dǎo)血管內(nèi)皮細(xì)胞凋亡、促進(jìn)內(nèi)膜炎性因子釋放。流行病學(xué)研究已經(jīng)證實(shí)這兩種TFAs誘導(dǎo)動(dòng)脈粥樣硬化（AS）程度具有顯著差異。近年來(lái)的研究表明，脂筏內(nèi)富含脂類和一些與細(xì)胞信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)有關(guān)的組分，這可能就為信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)的有效進(jìn)行和各種信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑的“cross talk”提供平臺(tái)。已有文章報(bào)道，多不飽和脂肪酸如二十碳五烯酸（EPA）、二十二碳六烯酸（DHA）等可以改變脂筏結(jié)構(gòu)，DHA還可改變脂筏脂肪環(huán)境調(diào)節(jié)白細(xì)胞介素2受體信號(hào)通路。因此猜測(cè)TFAs對(duì)細(xì)胞的影響可能與脂筏結(jié)構(gòu)有關(guān)，一方面可能通過(guò)改變脂筏脂肪酸和磷脂組成而影響細(xì)胞，一方面可能通過(guò)刺激脂筏上受體而誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡。本研究將對(duì)比用脂筏破壞劑破壞細(xì)胞膜脂筏與否，TFAs對(duì)細(xì)胞信號(hào)的影響，探討脂筏及其受體在TFAs引起細(xì)胞凋亡中的重要作用，為我國(guó)心血管疾病的病因及其防治提供科學(xué)依據(jù)。 本研究首先建立脂筏破壞模型，確定脂筏破壞劑的合理作用時(shí)間，在不引起細(xì)胞形態(tài)及生理指標(biāo)變化的情況下，采用MTT法觀察9t18:1和9t12t18:2對(duì)內(nèi)皮細(xì)胞活力的影響，通過(guò)流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)TFAs對(duì)細(xì)胞凋亡和周期的影響，進(jìn)一步通過(guò)Western-Blot分析TFAs對(duì)凋亡相關(guān)蛋白（caspase-3、-8、-9、Bax、Bcl-2、Bid、p53等）和周期相關(guān)蛋白（p21、p27、CDK2、CDK4、CyclinD1等）表達(dá)量的影響，探討脂筏對(duì)TFAs誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡及周期變化的影響。根據(jù)前期結(jié)果，通過(guò)Western-Blot分析脂筏上凋亡受體表達(dá)，再運(yùn)用熒光顯微鏡觀察脂筏上受體變化，最后通過(guò)高效氣相色譜法分析TFAs對(duì)細(xì)胞脂肪酸組成的影響，得到反油酸誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡的受體通路。與此同時(shí)，通過(guò)以上方法和指標(biāo)對(duì)比了脂筏在不同飽和度TFAs誘導(dǎo)細(xì)胞生理變化中的介導(dǎo)作用。主要取得如下研究成果： 1.成功建立脂筏破壞模型。脂筏破壞劑MβCD在作用濃度為10mM時(shí)，其不引起人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞活力發(fā)生顯著變化的時(shí)間為60min以內(nèi)，超過(guò)60min內(nèi)皮細(xì)胞微觀形態(tài)開(kāi)始改變，甚至細(xì)胞死亡。在40min時(shí)細(xì)胞膜膽固醇含量有明顯減低，在50min時(shí)脂筏的標(biāo)志蛋白（小窩蛋白）表達(dá)量有顯著下降，說(shuō)明在40-60min時(shí)，MβCD即可去除脂筏又不會(huì)影響細(xì)胞的生理功能，因此確定脂筏破壞劑作用濃度為10mM，作用時(shí)間為50min。 2.脂筏參與TFAs誘導(dǎo)的細(xì)胞凋亡。TFAs可降低細(xì)胞活力，促使細(xì)胞凋亡。但TFA作用于去除脂筏的內(nèi)皮細(xì)胞時(shí)，細(xì)胞活力下降減少，凋亡細(xì)胞數(shù)降低，凋亡相關(guān)蛋白（caspase-3、-8、-9、Bax、Bcl-2、Bid、p53等）表達(dá)量下降，且同濃度（50μmol/L）的9t12t18:2對(duì)上述指標(biāo)降低能力比9t18:1大，說(shuō)明脂筏參與了TFAs誘導(dǎo)的細(xì)胞凋亡，且對(duì)9t12t18:2引起的凋亡能力更大。 3.脂筏參與TFAs誘導(dǎo)的細(xì)胞周期改變。當(dāng)脂筏功能受干擾后，9t18:1和9t12t18:2均能促進(jìn)內(nèi)皮細(xì)胞由G0/G1期進(jìn)入S期，使處于增殖期的細(xì)胞數(shù)量百分比明顯增加；對(duì)周期相關(guān)蛋白（p21、p27、CDK2、CDK4、CyclinD1等）表達(dá)量也有顯著影響。 4.9t18:1和9t12t18:2均能增加ICAM-1、VCAM-1、E-selectin等炎癥因子表達(dá)量，同濃度下反亞油酸促炎效果更強(qiáng)；去除脂筏后，炎癥因子表達(dá)顯著降低，說(shuō)明破壞脂筏對(duì)炎癥有抑制作用。 5.9t18:1作用于內(nèi)皮細(xì)胞，可使凋亡受體Fas聚集在細(xì)胞膜上，當(dāng)去除脂筏后，凋亡受體及配體表達(dá)下降，其下游凋亡蛋白表達(dá)也降低，由此推測(cè)反油酸作用于細(xì)胞脂筏，刺激Fas受體與其FasL配體結(jié)合，并激活下游凋亡通路，引起細(xì)胞凋亡。
【學(xué)位單位】：南昌大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位年份】：2014
【中圖分類】：R54
【部分圖文】：

Fig. 1.1 The possible pathway of TFAs induced vascular cell injury上游信號(hào)受體還未知，TFAs 是否通過(guò)細(xì)胞膜上蛋白受體胞周期、細(xì)胞凋亡和炎癥通路及其他信號(hào)通路尚不得而知可見(jiàn)，膳食中 TFAs 含量及攝入量將誘發(fā)心血管疾病特別發(fā)展，通過(guò)研究不同飽和度的 TFAs 對(duì)血管壁細(xì)胞的影響

圖 1.2 脂筏組成及結(jié)構(gòu)Fig. 1.2 Composition and structure of lipid rafts1.3.2 脂筏的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)功能觀察研究發(fā)現(xiàn)，脂筏上存在多種與信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)有關(guān)的特殊蛋白質(zhì)，使其參

圖 2.1 MβCD 不同作用時(shí)間對(duì) HUVEC 活力的影響Fig.2.1 Effect of different MβCD reaction time on cell viability of HUVEC注：數(shù)據(jù)表示為X ±SD，n=6，無(wú) MβCD 作用時(shí)細(xì)胞存活率設(shè)為 100%，*表示有顯著差異（p<0.05）.4.2 MβCD 不同作用時(shí)間對(duì) HUVEC 微觀形態(tài)的影響
【參考文獻(xiàn)】

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本文編號(hào)：2890669